实验六现代免疫学检测技术:ELISA.ppt
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1、实验六实验六 现代免疫学检测技术:现代免疫学检测技术:ELISA ELISA 1.1.了解了解ELISAELISA的原理及其优点,的原理及其优点,2.2.掌握掌握试剂盒试剂盒的使用。的使用。3.3.学习学习ELISAELISA的实验操作过程及其应用。的实验操作过程及其应用。一、实验目的一、实验目的 免疫酶技术免疫酶技术 (酶免疫测定法)(酶免疫测定法)免疫酶技术免疫酶技术:将将抗原抗体抗原抗体反应的特异性,与反应的特异性,与酶反应酶反应的敏的敏感性相结合的一种方法。它以感性相结合的一种方法。它以酶酶作为作为标记物,与抗体(或抗标记物,与抗体(或抗原,抗抗体)原,抗抗体)联结联结,形成,形成酶标
2、抗体酶标抗体(抗原,抗抗体),其与(抗原,抗抗体),其与相应的抗原(或抗体)作用后,通过相应的抗原(或抗体)作用后,通过底物的颜色反应进行底物的颜色反应进行抗抗原(抗体)的原(抗体)的定性定性和和定量(酶标测定仪)定量(酶标测定仪),亦可用于组织中,亦可用于组织中抗原或抗体的抗原或抗体的定位定位研究,即酶免疫组织化学技术。研究,即酶免疫组织化学技术。目前目前应用最多应用最多的免疫酶技术的免疫酶技术是是酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(ELISAELISA)。)。二、实验原理二、实验原理 ELISAELISA简介简介 1971 1971年年瑞典瑞典学者学者 Engvall Engvall 和和P
3、erlmannPerlmann,荷兰荷兰学者学者Van WeemanVan Weeman和和 Schuurs Schuurs分别报道将免疫分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,称为方法,称为酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(ELISAenzyme-linked immunosorbent assay)ELISAELISA基本的实验过程基本的实验过程包被包被:将已知:将已知抗原或抗体抗原或抗体通过物理吸附到通过物理吸附到固相载固相载体体表面,使抗原或抗体表面,使抗原或抗体固相化。固相化。抗原抗体反应抗原抗体反应:先后加入:先后加入
4、被检标本被检标本和和酶结合物酶结合物,使之使之与固相抗原与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合或抗体发生免疫反应而被结合固固定。定。酶促反应酶促反应:在反应体系中:在反应体系中加入加入酶作用的酶作用的底物底物,使,使发生酶促反应而发生酶促反应而显色显色。ELISAELISA:根据检测目的和操作步骤不向,:根据检测目的和操作步骤不向,有以下有以下三种类型三种类型的常用方法。的常用方法。酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验间接法间接法 双抗夹心法双抗夹心法 竟争法竟争法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法 (1)包被包被固相抗体固相抗体(室(室温放置,厂家完成)温放置,厂家完成)(2)加入待
5、检加入待检样品(抗原)样品(抗原)抗体抗体抗原抗原ELISAELISA检测检测双抗体夹心法双抗体夹心法(测抗原)(测抗原)放大的反应小孔放大的反应小孔酶标抗体酶标抗体 (4)(4)加入酶反应底物后显色加入酶反应底物后显色 (HRP HRP酶与底物反应后酶与底物反应后,显兰色)显兰色)底物底物(3)(3)加入酶标抗体试剂加入酶标抗体试剂 (夹心饼干形成夹心饼干形成!)ELISAELISA检测检测双抗体夹心法双抗体夹心法(测抗原)(测抗原)ELISAELISA检测检测双抗原夹心法双抗原夹心法(测抗体测抗体)与双抗体夹心法区别:与双抗体夹心法区别:(1 1)包被抗原包被抗原(2 2)检测样品)检测样
6、品待测抗体待测抗体,如血清等。,如血清等。(3 3)酶标抗原酶标抗原酶标板酶标板酶标仪三、实验内容三、实验内容1.1.采用采用双抗原双抗原夹心法夹心法,测定测定乙型肝炎表面乙型肝炎表面抗抗体(体(HBsAbHBsAb),学习乙型肝炎学习乙型肝炎表面抗体表面抗体诊断诊断试剂盒试剂盒的使用方法。的使用方法。2.2.采用采用双抗体双抗体夹心法夹心法,测定测定乙型肝炎表面乙型肝炎表面抗抗原原(HBsAgHBsAg),学习乙型肝炎学习乙型肝炎表面抗原表面抗原诊断诊断试剂盒试剂盒的使用方法。的使用方法。1 1乙肝病毒表面抗体乙肝病毒表面抗体(HBsHBsAbAb)诊断试剂盒。诊断试剂盒。预包被预包被微孔条
7、微孔条(包被(包被纯化纯化HBsAgHBsAg)酶结合物酶结合物:辣根过氧化物酶:辣根过氧化物酶标记标记HBsHBsAgAg (HBsHBsAgAg-HRP-HRP )抗抗HBsHBs阳性对照阳性对照抗抗HBsHBs阴性对照阴性对照洗涤液洗涤液(浓缩液,用前以蒸馏水稀释浓缩液,用前以蒸馏水稀释,按说明,按说明)底物底物A A(H H2 2O O2 2 )、)、底物底物B B(四甲基联苯胺(四甲基联苯胺)和)和终止液终止液(HClHCl及及2 mol/L H2 mol/L H2 2SOSO4 4)。)。四、实验材料四、实验材料2 2乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗原(HBsHBsAgAg)诊断试剂
8、盒。诊断试剂盒。预包被微孔条预包被微孔条(包被(包被纯化纯化HBsHBsAbAb)酶结合物酶结合物:辣根过氧化物酶标记:辣根过氧化物酶标记HBsHBsAbAb (HBsHBsAbAb-HRP-HRP )HBsAgHBsAg阳性对照血清阳性对照血清 HBsAgHBsAg阴性对照血清阴性对照血清洗涤液洗涤液(浓缩液,用前以蒸馏水稀,按说明浓缩液,用前以蒸馏水稀,按说明)底物底物A A、B B和终止液和终止液。3 3微量加样器,吸水纸等微量加样器,吸水纸等。四、实验材料四、实验材料1.1.待检测样品待检测样品 待测待测血清血清4 4种种:1 1号、号、2 2号、号、3 3号、号、4 4号号 注意:待
9、测血清是从医院采集的正常血清注意:待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体人为加进去乙肝表面抗原或者抗体),但,但是并不表示血清中不含有可传染的疾病,是并不表示血清中不含有可传染的疾病,所以实验中要所以实验中要注意安全注意安全。五、实验步骤五、实验步骤2.2.分组分组:每:每4 4人一组人一组,每组有检测,每组有检测HBsAgHBsAg和检测和检测抗体(抗体(抗抗HBsAgHBsAg)的的2种试剂盒种试剂盒。反应条反应条各各1 1条条,每条含每条含6 6个反应孔。个反应孔。1 1个孔做阳性对照,个孔做阳性对照,1 1个孔阴性对照,个孔阴性对照,4 4个做样个做样品检测。品
10、检测。本实验本实验空白对照孔空白对照孔不设。不设。五、实验步骤五、实验步骤3.3.检测方法检测方法 (1 1)加样:)加样:每孔加每孔加待检血清待检血清50ul50ul,每次实验各做每次实验各做1 1个个阴性对照阴性对照和和阳性对阳性对照照。注意:注意:每位同学选择一种待测血清进每位同学选择一种待测血清进行检测行检测(见下图)(见下图)。五、实验步骤五、实验步骤阴性阴性 阳性阳性 待检血清待检血清1 1号号,2,2号号,3,3号号,4 4号号.对照对照 对照对照 1 1号同学号同学取待测取待测血清血清1 1号号阴性阴性 阳性阳性 待检血清待检血清1号号,2号号,3号,号,4号号.对照对照 对照
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