《基因操作工具酶》PPT课件.ppt
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1、第一节第一节 基因操作工具酶基因操作工具酶 第二节第二节 核酸的分离纯化核酸的分离纯化第三节第三节 聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)第四节第四节 凝胶电泳系统凝胶电泳系统第五节第五节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交第六节第六节 载体系统载体系统第十章第十章 分子生物学实验技术分子生物学实验技术 第一节第一节 基因操作工具酶基因操作工具酶酶酶酶酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶逆转录酶逆转录酶DNA连接酶连接酶末端转移酶末端转移酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 S1核酸酶核酸酶Klenow酶酶DNA酶酶 Taq DNA 聚合酶聚合酶RNA酶酶A多核苷酸激酶多核苷酸激酶碱性磷酸酶碱性磷酸
2、酶基因工程操作中最常用的工具酶基因工程操作中最常用的工具酶主要内容主要内容1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 2 DNADNA连接酶连接酶3 3 DNADNA聚合酶聚合酶4 4 修修 饰饰 酶酶5 5 小小 结结酶酶主要用途主要用途限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别识别DNA特定序列,切割特定序列,切割DNA分子分子DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA分子或片段分子或片段大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶 或或Klenow酶酶1 制作制作DNA探针;探针;2 合成合成cDNA第二链;第二链;3 填补双链填补双链DNA 3凹端;凹端;4 DNA测序。测序。Taq DNA 聚合酶聚合
3、酶聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)多核苷酸激酶多核苷酸激酶多核苷酸多核苷酸5-OH磷酸化,制末端标记探针磷酸化,制末端标记探针末端转移酶末端转移酶使使3-末端加同聚物尾末端加同聚物尾S1核酸酶核酸酶降解单链降解单链DNA或或RNADNA酶酶在双链在双链DNA上产生随机切口上产生随机切口RNA酶酶A降解降解RNA逆转录酶逆转录酶补平反应,合成补平反应,合成cDNA或制探针或制探针碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.1 引引 言言1.2 命命 名名1.3 分分 类类1.4 活性及影响因素活性及影响因素Ho
4、me核酸酶核酸酶(Nuclease):通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键,通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键,导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。(1)按作用对象分)按作用对象分:DNAase&RNAase(2)按断裂核酸分子不同方式分:)按断裂核酸分子不同方式分:Endonuclease&Exonuclease 1.1 引言引言两个概念两个概念限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restriction endonuclease):指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸分子中特定核苷酸序列,并在识别序列内或附近特异切割双链
5、序列,并在识别序列内或附近特异切割双链DNADNA的核酸内切酶。的核酸内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制限制-修修饰系统饰系统(Restriction-Modification System)。Back1.2 命命 名名命名原则:命名原则:第一个字母第一个字母(大写(大写,斜体斜体):):该酶来源的微生物该酶来源的微生物属名属名;第二、三个字母第二、三个字母(小写、(小写、斜体斜体):微生物):微生物种名种名;若该微生物有不同的若该微生物有不同的变种和品系变种和品系,再加上该变种和品系的,再加上该变种和品系的第一个第一个字母(大写)字母(大写)若从同一微生
6、物发现多种限制性内切酶,则依照发现和分离的若从同一微生物发现多种限制性内切酶,则依照发现和分离的先先后顺序用罗马字母表示后顺序用罗马字母表示。例如:例如:EcoR 从大肠杆菌从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为株分离的第一种限制酶命名为EcoR,其中其中E 代表属名(代表属名(Escherichia),co 代表种名(代表种名(coli),R 代表代表株系(株系(RY13),),代表该菌株中首次分离到。代表该菌株中首次分离到。Back1.3 分分 类类1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶Back1.3.1 1.3.1
7、型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:限制、修饰限制、修饰特点:特点:需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅辅助因子;助因子;识别位点和切割位点不一致,识别位点和切割位点不一致,无固定切割位点;无固定切割位点;应用:应用:不常用。不常用。Back1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:限制、修饰限制、修饰特点:特点:需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助因辅助因子;子;特异切割,切割位点在距识别位点特异切割,切割位点在距识别位点33端端24-26 bp24-26 bp处。处。应用:应用:数量很少,无实际作用。数
8、量很少,无实际作用。Back1.3.3 1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:识别并特异切割识别并特异切割DNADNA分子。分子。即通常所指即通常所指DNADNA限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;反应特点:反应特点:仅需仅需 Mg Mg2+2+作催化反应辅助因子,作催化反应辅助因子,能识别双链能识别双链DNADNA特殊序列,并可特异切割特殊序列,并可特异切割DNADNA,产生特异片段;,产生特异片段;应用:应用:种类繁多,分子克隆中最为常用种类繁多,分子克隆中最为常用(1)基本特性基本特性识别长度为识别长度为4-84-8个核苷酸的特异序列;个核苷酸的特异序列;许多识别序列具许多
9、识别序列具回文结构回文结构,如,如HinHind d 的识的识别序列:别序列:5 AAGCTT 3 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCGAA 5切割产生末端有切割产生末端有粘端粘端(cohesive/sticky (cohesive/sticky end)end)如如BamBamH I(GGATCC)H I(GGATCC)和和平端平端 (blunt end)(blunt end)如如SmaSma I(CCC GGG)I(CCC GGG)Enzyme Recognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBamH IGGATCCPst I
10、CTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases(2)同功异源酶同功异源酶(isoschizomer)来源不同但能识别和切割同一位点的酶。来源不同但能识别和切割同一位点的酶。
11、又称同裂酶。又称同裂酶。如:如:BamH I(GGATCC)和和Bst I(G GATCC)注:有一些同功异源酶对于切割位点上的甲注:有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。基化碱基的敏感度有所不同。(3)同尾酶(同尾酶(isocaudamer)识别序列不同,但产生相同粘性末端的限制酶。识别序列不同,但产生相同粘性末端的限制酶。如:如:BamH I:GGATCC Bgl II:AGATCTBack1.4 1.4 活性及影响因素活性及影响因素(1)活性大小:酶对活性大小:酶对DNA水解程度不同。水解程度不同。(2)酶的活性单位:酶的活性单位:指指1g 纯的指定纯的指定DNA在
12、指定缓冲液中,于在指定缓冲液中,于37(最适温度更准确最适温度更准确)酶解)酶解1 h完全酶解完全酶解DNA中所有中所有同一限制性内切酶位点同一限制性内切酶位点所需的酶量。所需的酶量。(3)影响因素影响因素 DNA模板的纯度模板的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应温度酶切反应温度 DNA的分子结构的分子结构 缓冲液缓冲液Back2 DNA连接酶连接酶2.1 定义及功能定义及功能2.2 种类及作用机理种类及作用机理2.3 使用时的注意事项使用时的注意事项Home2.1 定义及功能定义及功能 DNA DNA连接酶(连接酶(DNA ligaseDNA ligase):):可使一段可使一段
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