实验一碱变性法抽提质粒DNA.ppt
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1、梁晓红梁晓红 王晓燕王晓燕山东大学医学院免疫学研究所山东大学医学院免疫学研究所2011-6医学分子生物学实验医学分子生物学实验基因克隆实验技术部分基因克隆实验技术部分共共100分分实验设计实验设计60%考勤考勤+实验报告实验报告40%实验设计(实验设计(30004000字):字):选题:结合自己的专业,利用基因工程技术选题:结合自己的专业,利用基因工程技术内容:内容:1)立题依据;)立题依据;2)原理;)原理;3)实验材料;)实验材料;4)实)实验方法;验方法;5)预期结果;)预期结果;6)参考文献()参考文献(3篇)篇)评分标准:评分标准:1)项目完整)项目完整35分;分;2)创新性)创新性
2、15分;分;3)可行性)可行性5分;分;4)合理性)合理性5分。分。注意事项注意事项1.分组(分组(4 4人人/组)组)2.2.隔离衣隔离衣3.3.离心机、移液器等使用离心机、移液器等使用Restriction enzymes:选(分)选(分)切切接接转转筛筛扩扩重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程总体实验安排总体实验安排上午上午下午下午1碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNADNA核酸浓度和纯度分析核酸浓度和纯度分析核酸电泳及分子量测定核酸电泳及分子量测定质粒质粒DNADNA的酶切的酶切2感受态细胞的制备感受态细胞的制备质粒质粒DNADNA的酶切产物电泳的酶切产物电泳试剂盒回收试剂盒
3、回收DNADNA目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接3重组子筛选、鉴定方法重组子筛选、鉴定方法蓝白斑筛选蓝白斑筛选真核基因组真核基因组DNADNA抽提抽提1 1连接子的转化连接子的转化真核基因组真核基因组DNADNA抽提抽提2 24菌落的菌落的PCRPCR鉴定鉴定PCRPCR产物的电泳产物的电泳实验一实验一碱变性法抽提质粒碱变性法抽提质粒DNA质粒(质粒(plasmid)质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子是一种染色体外的稳定遗传因子,为为双链、闭环的双链、闭环的DNA分子分子,并以并以超螺旋状态超螺旋状态存在于宿存在于宿主的细胞质中。主的细胞质中。质粒主要发现于细菌、放
4、线菌和真菌细胞中,它质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒能在子代细胞中保持恒定的拷贝数定的拷贝数,并并表达所携带的遗传信息表达所携带的遗传信息。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生如对抗生素的抗性等。素的抗性等。存在于细菌染色体外的小存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链的共价、闭环双链DNADNA分分子。子。(1)质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型:严紧控制型严紧控制型(Strengent control)Strengent control):复制受
5、宿复制受宿主细胞的严格调控,拷贝数低;主细胞的严格调控,拷贝数低;松驰控制型松驰控制型(Relaxed control)(Relaxed control):复制不受宿:复制不受宿主细胞的调控,拷贝数高主细胞的调控,拷贝数高,适用于基因工程中做适用于基因工程中做载体。载体。分离质粒分离质粒DNA的方法的方法1.碱变性法;碱变性法;2.煮沸法;煮沸法;3.SDS法;法;4.羟基磷灰石层析法等羟基磷灰石层析法等一、实验目的一、实验目的 通过本实验掌握碱变性法提取质粒通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNADNA。二、实验原理二、实验原理在时,线性在时,线性DNADNA被彻底变性,但共价闭环质粒被彻底变性
6、,但共价闭环质粒DNADNA虽然氢虽然氢键也发生断裂,但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。键也发生断裂,但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入的当在溶液体系中加入的NaACNaAC时,溶液恢复中性,质粒时,溶液恢复中性,质粒DNADNA迅速复性,染色体迅速复性,染色体DNADNA不能恢复,形成网状结构,通过离不能恢复,形成网状结构,通过离心可以把变性的染色体心可以把变性的染色体DNADNA和蛋白和蛋白-SDS-SDS复合物沉淀分离出复合物沉淀分离出来来。质粒DNA细菌染色体DNA分子量小分子量大超螺旋线性双螺旋三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂(一)(一)仪器仪器
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