目的基因的表达第五章-黑板.ppt
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1、第五章第五章 外源基因的表达外源基因的表达(the expression of foreign gene)第一节第一节 外源基因的表达体系外源基因的表达体系原核生物转录过程RNA聚合酶亚基发现启动子序列与-35区结合 进一步与-10区结合 解链(17bp)使模板暴露 因子识别并起始启动位点 pppA/pppG 因子解离,NusA与RNA聚合酶结合(放松)RNA聚合酶向前滑动,继续解12bp链 终止(依赖因子、不依赖 因子)一、基因表达的机制外源基因的起始转录:可调控的启动子外源基因的起始转录:可调控的启动子mRNA的延伸与稳定性的延伸与稳定性外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译(起始密
2、码子、(起始密码子、SD序列、序列、SD序列与起始序列与起始密码子之间的距离为密码子之间的距离为39个碱基)个碱基)表达蛋白在细胞中的稳定表达蛋白在细胞中的稳定目的基因沉默目的基因沉默(位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默)默、转录后水平的基因沉默)二、外源基因表达系统二、外源基因表达系统概念:概念:目的基因与目的基因与表达载体表达载体重组后,导入合适的重组后,导入合适的受体细受体细胞胞,并在其中有效表达,产生目的基因产物。,并在其中有效表达,产生目的基因产物。原核生物基因表达系统原核生物基因表达系统(大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系
3、统、链霉菌大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统)表达系统和蓝藻表达系统)真核生物基因表达系统真核生物基因表达系统原核基因表达系统原核基因表达系统生长快,可通过发酵获得大量基因表达产物生长快,可通过发酵获得大量基因表达产物基因组结构简单,便于基因操作与分析基因组结构简单,便于基因操作与分析多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体,便于构建多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体,便于构建相应的表达载体相应的表达载体生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚不具备真核生物的蛋白质加工系统,表达产物无特不具备真核生物的蛋白质加工系统,表达产物无特定的
4、空间构象定的空间构象内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白,造成表达产物内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白,造成表达产物的不稳定性的不稳定性大肠杆菌基因表达载体复制子复制子启动子和终止子启动子和终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子(简并密码子的选择)密码子(简并密码子的选择)选择标记(抗生素抗性基因)选择标记(抗生素抗性基因)三、制约目的基因表达的因素1、外源基因是否插入在正确的阅读框架、外源基因是否插入在正确的阅读框架2、目的基因的有效转录(如启动子的作用)、目的基因的有效转录(如启动子的作用)3、mRNA的有效翻译(如的有效翻译(如SD序列等作用)序列等作用)4、转录后,翻译后的适当的修饰和加工过
5、程、转录后,翻译后的适当的修饰和加工过程 四、阅读框架四、阅读框架 在在DNA链上链上,由蛋白质合成的起始密码开始由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密到终止密码子为止的一个连续编码序列码子为止的一个连续编码序列,叫做一个开放阅读框叫做一个开放阅读框架(架(open reading frame,ORF)五、启动子与转录的影响五、启动子与转录的影响 1、在原核细胞的转录过程中,决定外源基因表达的、在原核细胞的转录过程中,决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制的启动子控制之下,而且启动子又能被宿主细胞中的之下,而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚
6、合酶聚合酶有效识别。有效识别。选择填空2、启动子、启动子DNA序列中两个高度保守区域是必序列中两个高度保守区域是必须的(须的(-10区与区与-35区),没有这两个高度保守区),没有这两个高度保守区域,就没有启动作用。但是启动子区域,就没有启动作用。但是启动子DNA序序列中保守性较差部分和两个保守区之间的核列中保守性较差部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的功能苷酸数量也影响启动子的功能。LacUv5 trp启动子启动子 trp-lacUv5启动子启动子(1)原原核核生生物物:大大约约在在RNA合合成成起起点点之之前前的的10bp和和35bp处处,由由两两个个由由6个个核核苷苷酸酸组组成
7、成的的共共有序列有序列 -10区区:TATAAT(the pribnow box)-35区区:TTGACA(2)真核生物真核生物 -30区:区:TATA盒:盒:TATAAAA -80区:区:CAAT盒:盒:GGTCAATCT 六、翻译过程对表达的影响 1、SD序序列列与与rRNA的的16s亚亚基基3末末端端序序列列之之间间的互补程度,是影响翻译效率的主要因素。的互补程度,是影响翻译效率的主要因素。2、起起始始密密码码AUG与与SD序序列列之之间间的的距距离离以以及及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。序列的核苷酸组成也影响翻译能力。3、起起始始密密码码之之后后的的一一个个核核苷苷酸酸对对mRN
8、A与与核核糖体的结合也有影响。糖体的结合也有影响。4、基因末端的转录终止区的影响、基因末端的转录终止区的影响 第二节第二节 外源基因在原核细胞外源基因在原核细胞 中的表达中的表达 一、基因工程的表达系统一、基因工程的表达系统 1、克隆原核基因在原核细胞中表达、克隆原核基因在原核细胞中表达2、克隆真核基因在原核细胞中表达、克隆真核基因在原核细胞中表达3、克隆原核基因在真核细胞中表达、克隆原核基因在真核细胞中表达4、克隆真核基因在真核细胞中表达、克隆真核基因在真核细胞中表达原核表达系统:原核表达系统:大肠杆菌系统大肠杆菌系统枯草杆菌系统枯草杆菌系统 真核表达系统:真核表达系统:低等真核细胞(酵母)
9、系统低等真核细胞(酵母)系统哺乳动物细胞系统哺乳动物细胞系统昆虫细胞系统昆虫细胞系统 真核基因在原核细胞中表达的困难1、细菌、细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。聚合酶不能识别真核基因的启动子。2、从从真真核核基基因因转转录录的的mRNA缺缺乏乏SD序序列列,不不能能结结合合到核糖体蛋白上。到核糖体蛋白上。3、真真核核基基因因一一般般含含有有内内含含子子,而而原原核核细细胞胞缺缺乏乏真真核核细细胞胞转转录录后后加加工工系系统统,mRNA中中的的内内含含子子不不能能切切除除,成熟的成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白质。不能形成,不能表达真核蛋白质。4、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳
10、定,容易被、表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳定,容易被细菌蛋白酶破坏细菌蛋白酶破坏 2 起始密码子的正确选读起始密码子的正确选读 噬菌体蛋白噬菌体蛋白A:5mRNA GUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU 3 rRNA 5 ACCUCCUA 3 Q噬菌体复制酶:噬菌体复制酶:5 mRNA UUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3 rRNA 5 ACCUCCUA 3二、原核系统高效表达外源真核基因 的措施 1、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和、将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD 序列的下游序列的下游2、从真核细胞中分离、从真核细胞中分离mRNA并反转录成并反转录
11、成cDNA3、将真核基因插在几个原核密码之后,通过翻译,通过翻译、将真核基因插在几个原核密码之后,通过翻译,通过翻译得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白。牛的凝血因子牛的凝血因子Xa能识别特异的能识别特异的4肽顺序:肽顺序:Ile(异亮)(异亮)-Glu(谷)(谷)-Gly(甘)(甘)-Ary(精)(精)原核多肽原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用真核蛋白。用Xa水解,分离出真核水解,分离出真核蛋白蛋白 4、减轻宿主细胞的代谢负荷,提高外源基因的表达水平 将细胞的生长和外源基因的表达分开成为将细胞的生长和外源基因的表达分开
12、成为两个阶段,以便减低宿主细胞的代谢负荷两个阶段,以便减低宿主细胞的代谢负荷 三、基因表达产物的检测与分离纯化三、基因表达产物的检测与分离纯化1、基因表达产物的检测基因表达产物的检测1.1 外源基因转录产物的检测外源基因转录产物的检测 Northern印迹杂交、印迹杂交、RT PCR1.2 报告基因的酶法检测报告基因的酶法检测 氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)葡萄葡萄糖苷酸酶基因等糖苷酸酶基因等(GUS)1.3 表达产物生物学活性检测表达产物生物学活性检测2、基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化细胞破碎细胞破碎 离心离心 沉淀法、超滤浓沉淀法、超滤浓缩法分离特异表达蛋
13、白缩法分离特异表达蛋白 进一步分离柱进一步分离柱层析层析 聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳mRNA差异差异显显示技示技术术及其及其应应用用一、一、mRNA差别显示技术概述差别显示技术概述n高等生物大约有高等生物大约有3 3万万5 5万个基因万个基因n在任一细胞表达的基因约占总数的在任一细胞表达的基因约占总数的15%15%n哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达,决定了整个生命过程。态下表达,决定了整个生命过程。n比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异,是克隆特异表达基因的方法。达的差异,是克隆特异表
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