《信号转导研究方法》PPT课件.ppt
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1、信号信号转导通路通路研究策略和研究策略和常用方法常用方法 搞懂信号通路搞懂信号通路 查找文献,找文献,了解信号系了解信号系统的研究的研究进展和展和热点点 找到研究点找到研究点功能分析功能分析表达分析表达分析如何分析信号蛋白?如何分析信号蛋白?何何时何地表达何地表达 基因基因过表达表达,或,或基因基因沉默沉默(细胞水平和整体水平胞水平和整体水平)相互作用蛋白相互作用蛋白 立体立体论证 基因水平基因水平 转录水平转录水平 转录后加工转录后加工 翻译水平翻译水平 翻译后加工翻译后加工 mRNA和蛋白质降解和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节蛋白质基因表达可以在不同层次上调节基因表达分析方法
2、基因表达分析方法启启动子分析子分析:-EMSA-Reporter gene assay-CHIP assay-Nuclear Run-on assay-DNA Foot-printing assay-DNA truncation and site-directed mutagenesis翻翻译水平分析水平分析:-Western Blots-Immunocytochemistry Immunohistochemistry-Protein modification-Proteomics转录水平分析水平分析:-RT-PCR-Real Time PCR-In situ hybridization-No
3、rthern blots-RNase protection assay-Primer extention assay比比较转录组学学:-Differential screening-Subtractive hybridization-Differential display-Array-based methods1.蛋白蛋白质表达水平和表达水平和细胞内定位研究胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平信号蛋白分子表达水平检测:Western blot analysis.ELISA Proteomics 信号蛋白分子在信号蛋白分子在细胞内定位研究胞内定位研究:Immunohistochemistry/I
4、mmunocytochemistry Immunofluorescence(IF)Green fluorescent protein(GFP)-fusion proteintypically,live cells.印迹技印迹技术 blottingn将在凝胶中分离的生物大分子将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介移到固相化介质上,并加上,并加以以检测分析的技分析的技术。n应用:用:DNA、RNA、蛋白、蛋白质的的检测 DNA 印迹印迹:Southern blottingRNA 印迹印迹:Northern blotting蛋白蛋白质印迹印迹:Western blottingn又又称称蛋蛋白白质印
5、印迹迹技技术或或免免疫疫印印迹迹技技术。蛋蛋白白质经聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳分分离离后后转移移(电转)至至膜膜性性支支持持物物上上(NC(NC膜膜),再与溶液中的抗体相互再与溶液中的抗体相互结合的技合的技术。n主主要要用用于于检测样品品中中特特异异性性蛋蛋白白质的的存存在在、细胞胞中中特特异异蛋蛋白白质的的半半定定量量分分析析、蛋蛋白白质化化学学修修饰(磷磷酸酸化化),以以及蛋白及蛋白质分子分子间的相互作用研究等。的相互作用研究等。Western blottingElectrophoresis转膜膜 Protein HRPDABH2O21Ab2Ab抽提抽提细胞蛋白,定量胞蛋白,定量聚丙聚
6、丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳与特异性抗体与特异性抗体杂交。交。根据根据标记物特点物特点显色色硝酸硝酸纤维素膜素膜目的蛋白目的蛋白质抗目的蛋白一抗抗目的蛋白一抗标记的二抗的二抗偶偶联的碱的碱性磷酸性磷酸酶磷酸化生色体系磷酸化生色体系脱磷酸脱磷酸显色色采用采用Western blot方法方法检测蛋白蛋白质原理示意原理示意图应用举例应用举例n某某药物是否可引起目的蛋白的表达物是否可引起目的蛋白的表达变化(上化(上调或下或下调)?)?分分别抽提抽提细胞蛋白(未胞蛋白(未处理、理、药物物处理),定量理),定量 相同相同质量上量上样,聚丙,聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 印迹(印迹(电转移)移)杂交(抗体)交(抗
7、体)显色色/显影影 根据根据显影影结果判断:果判断:内参内参目目标蛋白蛋白检测标本很多的情况检测标本很多的情况下下WesternWestern 无法满足高通量的需求无法满足高通量的需求ELISA/Phosphospecific-ELISAs(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)检测蛋白蛋白质表达量或者活性状表达量或者活性状态(化学修化学修饰饰-磷酸化磷酸化)比比western blot更快速、更高效更快速、更高效.蛋白蛋白质组(proteome):):一个基因一个基因组所表达的全部蛋白所表达的全部蛋白质.蛋白蛋白质组学(学(proteomics):研究研究细胞、
8、胞、组织或生物体蛋白或生物体蛋白质组成及其成及其变化化规律的科学。律的科学。蛋白蛋白质组学学(Proteomics)同一基因同一基因组在不同在不同细胞、不同胞、不同组织中的表中的表达情况各不相同;达情况各不相同;在空在空间和和时间上呈上呈动态变化化蛋白蛋白质组学研究技学研究技术平台平台 (高效率高效率,高通量高通量)n 双向双向电泳分离泳分离样品蛋白品蛋白质n 蛋白蛋白质点的定位和切取点的定位和切取n 质谱分析分析第一向:第一向:等等电聚焦聚焦电泳泳(IEF)第二向:第二向:SDS-PAGE电泳泳 免疫免疫荧光技光技术Immunofluorescence(IF)n利用某些利用某些荧光素如光素如
9、FITC等通等通过化学反化学反应与抗体或其它蛋白与抗体或其它蛋白结合制合制备成成荧光探光探针,然后与被,然后与被测抗原或配体抗原或配体发生特异性生特异性结合,形成的合,形成的荧光复合物在一定波光复合物在一定波长光的激光的激发下可下可产生生荧光,因此利用光,因此利用荧光光显微微镜可可对抗原抗原进行定性或定位行定性或定位检测。n采用流式采用流式细胞免疫胞免疫荧光技光技术(FCM)可从)可从单细胞水平胞水平检测不同不同细胞胞亚群中的蛋白群中的蛋白质分子,用两种不同的分子,用两种不同的荧光素分光素分别标记抗不同蛋白抗不同蛋白质分子的抗体,可在同一分子的抗体,可在同一细胞内同胞内同时检测两种不同的分子(
10、两种不同的分子(Double IF),也可用多参数流式,也可用多参数流式细胞胞术对胞内多种分子胞内多种分子进行行检测。2.蛋白蛋白质与蛋白与蛋白质相互作用研究技相互作用研究技术:Co-IP(免疫共沉淀免疫共沉淀)with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeast two-hybrid assay FRET(fluorescence resonance energy transfer)assayagaro
11、se beadn IP 是利用抗原蛋白是利用抗原蛋白质和抗体的特异性和抗体的特异性结合以及合以及细菌蛋白菌蛋白质的的“protein A/G”能特异能特异结合免疫球蛋白合免疫球蛋白FC片段的片段的现象而象而发展展的方法。目前多用精制的的方法。目前多用精制的protein A/G预先先结合固化在合固化在agarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,后,beads上的上的prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。proteinA抗原抗原抗体抗体YABY裂解细胞裂解细胞 免疫沉淀蛋白质免疫沉淀蛋白质
12、X免疫共沉淀(免疫共沉淀(Co-IP)技)技术 非非变性条件下裂解性条件下裂解时,完整,完整细胞内存在的胞内存在的许多蛋白多蛋白质蛋白蛋白质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉的抗体免疫沉淀淀X,那么与,那么与X在体内在体内结合的蛋白合的蛋白质Y也能沉淀下来。也能沉淀下来。进一步一步进行行Western Blot和和质谱分析。常用于分析。常用于测定两种目定两种目标蛋白蛋白质是否在体内是否在体内结合,也可用于确定一种特定蛋白合,也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用的新的作用搭档。搭档。缺点:可能缺点:可能检测不到低不到低亲和力和瞬和力和瞬间的蛋白的蛋
13、白质相互作用。相互作用。Western Blot和和质谱分析分析Co-IP工作示意图工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYGST融合蛋白融合蛋白进行行Pulldown实验GST pull-down assay 原理原理 将将GST融合蛋白融合蛋白(tagged protein(标记蛋白蛋白)or the bait(饵蛋白蛋白),GST,His6,Flag,biotin)作作为探探针,与溶液中的特异性搭档蛋白与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein,or prey被扑被扑获蛋白蛋白)结合,然后根据谷胱甘合,然后根据谷胱甘肽琼
14、脂糖球珠能脂糖球珠能够沉淀沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干抗体干扰蛋白蛋白质蛋白蛋白质之之间的相互作用的相互作用时,可以启,可以启用用GST沉降技沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。方法只是用于确定体外的相互作用。GST-Pulldown Assay转录激活因子激活因子DNA结合合结构域构域(BD)转录激活激活结构域构域(AD)酵母双酵母双杂交技交技术 酵母双酵母双杂交技交技术是一种基于是一种基于转录重建而建立的重建而建立的研究生物大分子相互作用的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。便而有效的研究方法。n
15、在酵母在酵母细胞中分析蛋白胞中分析蛋白质相互作用。相互作用。n以真核以真核细胞胞转录激活因子的激活因子的结构构为基基础。n将将编码某某一一蛋蛋白白X的的DNADNA序序列列与与DNADNA结合合域域BDBD的的编码序序列列融融合合形形成成一一个个杂交交体体(“诱饵”bait)bait),将将编码另另一一蛋蛋白白Y的的DNADNA序序列列与与DNADNA激激活活域域ADAD的的编码序序列列融融合合形形成成另另一一个个杂交交体体(“猎物物”或靶蛋白或靶蛋白prey or target protein);prey or target protein);n当当两两个个杂交交体体共共转化化酵酵母母细胞胞
16、(此此酵酵母母细胞胞含含有有上上游游有有DNADNA结合合位位点点的的报告告基基因因),若若X和和Y没没有有相相互互作作用用,则单独独不不能能激激活活报告告基基因因的的转录;若若X X和和Y Y可可相相互互作作用用,则使使BDBD和和ADAD靠靠近近形形成成一一个个有有效效的的转录激激活活子子,激激活活报告告基基因因的的转录。因因此此可可通通过检测报告告基基因因的的转录来来研研究究蛋蛋白白质X X和和Y Y的的相互作用。但限于核内表达的蛋白相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。的相互作用。酵母双酵母双杂交系交系统 荧光光共共振振能能量量转移移(FRET)是是对生生物物大大分分子子之之间相
17、相互互作作用用定定性性、定定量量检测的的一一种种有有效效方方法法,是是在在活活体体细胞胞中中实时地地对生生物大分子之物大分子之间的相互作用的相互作用进行行动态监测.两个携两个携带不同不同荧光基光基团(如(如GFP、YFP、CFP等)等)的大的大分子在相互分子在相互间距离足距离足够近近时会会发生激生激发态能量非放射性地由一能量非放射性地由一个个荧光基光基团(供体)供体)向另一个向另一个荧光基光基团(受体)受体)转移的移的现象。象。如果如果发生生FRET,则供体信号将淬供体信号将淬灭而受体信号将激活或增而受体信号将激活或增强.FRET 检测系系统可以快速高效地捕可以快速高效地捕获来自来自标定分子定
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