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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 色素上皮衍生因子(PEDF)在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌治疗作用的讨论一、趋势判定和需求分析国内外现状、 水平和进展趋势 (含学问产权状况和技术标准状况) ;经济建设和社会进展需求;科学技术价值、特色和创新点;膀胱癌是危及人类健康的重大疾病,全世界范畴内统计其发病率占全身肿瘤的第8 位,在男性其标准发病率 9.9/10 万;在女性,其标准发病率为 2.3/10 万,占第 25 位;死亡率在男性为 4.2/10 万,占全身肿瘤死亡率的第 9 位,在女性为 1.1/10 万,占第 16 位;在我国 ,膀胱癌也是泌尿外科的最常见恶性肿瘤,占全身恶性肿
2、瘤的 3.2%,1995 年,北京市城区膀胱癌发病率大约为 7/10 万人,上海市城区发病率为 8.6/10万人 1 ,且今后发病率仍有上升趋势;作为危害人类健康的常见恶性肿瘤,膀胱癌发病机制和治疗方面的讨论始终是临床基础讨论的重点之一;目前膀胱癌的治疗仍以手术切除为主,辅以膀胱灌注化疗和免疫治疗、全身化疗、放疗和生物治疗等措施 , 但这些治疗方法成效都不中意,主要是治疗后易复发,复发率高达 80%,其中大约 16%-25%复发的肿瘤其恶性程度增加,有 10%进展为浸润性或转移性癌,因此 ,查找一种新的、更有效的生物治疗方法,是当前临床迫切需要解决的问题;在膀胱癌的这些帮助性治疗方法中,无论是
3、化疗仍是免疫治疗,主要机制是通过直接杀死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡的方式来抑制肿瘤生长;做为一种实体性肿瘤生长,肿瘤细胞的增殖当然重要,而新生血管的形成在肿瘤的生长和复发、转移过程中也发挥特别重要作用;在正常状态下,人体内的脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式的相互作用下处于平稳状态;病理状态下,特别是发生恶性肿瘤时,这种平稳向血管生成的方向进展;当肿瘤生长达到肿瘤组织超过 2mm 时就会有新生血管形成,假如没有新生血管生成,肿瘤生长明显受到抑制,甚至停止 前常规疗法的新的肿瘤治疗策略,具有高效低毒和不易产生耐药性的特点2,3;抗血管生成疗法是不同于目 4 ;有关血管生长因子和
4、血管生长抑制因子在肿瘤中所起作用,以及通过抗血管生成治疗肿瘤已经成为当前肿瘤讨论的一个热点;近来讨论发觉,色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF )是一种对肿瘤有抑制名师归纳总结 作用的细胞因子;这种细胞因子是Tombran-Tink 等在试验中发觉的,由人视网膜色素上皮细胞分泌的一第 1 页,共 9 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 种蛋白质,分子量为 50 KD5 ,属于 serpin 卵白蛋白 /PAT-2亚群,其基因全长 16 kb,位于染色体 17p13.1-pter 6 ;多项讨论
5、说明,PEDF 是一种自然的高效的新生血管抑制剂 7 ,并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑制肿瘤生长的作用;Tombran-Tink 等将 PEDF 基因定位于染色体 17p13.1,肿瘤发生与该区域关系亲密,提示该基因可能是抑癌基因或肿瘤相关基因 5 ;对肿瘤细胞进行编码 PEDF 的腺病毒转染,在血管内皮生长因子( Vascular endothelial growth factor ,VEGF )存在的情形下,PEDF 明显阻挡了血管内皮细胞管腔形成和迁移;对患有 CNV/AMD 患者的体外试验也发觉,PEDF 大量削减的情形下,内皮细胞有明显迁移 ;而对比组含有正常水平 PEDF,就抑制了内
6、皮细胞的迁移 6 ;Crawford 等发觉 PEDF 在神经母细胞瘤中是肿瘤细胞分化调控的主要的抗血管生成的抑制剂 7 ;肝癌患者血管增生和肿瘤进展中,PEDF 作为VEGF 的拮抗因子, 起到了抑制作用; 对裸小鼠的在体试验以及鼠的肺癌模型也同样证明白 PEDF 对肿瘤的抑制作用;其机制乃因 PEDF 削减肿瘤微血管的密度,因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成,从而抑制肿瘤的生长,在肿瘤的治疗前景上特别乐观 8 ;我们最近对 PEDF 在膀胱癌中表达情形的初步讨论发觉,PEDF 在膀胱癌组织中表达明显低于正常膀胱组织,而且 PEDF 表达情形与膀胱癌的恶性程度以及癌组织中微血管密度呈负相关,提
7、示 PEDF 在膀胱癌的发生、进展中具有肯定的作用,PEDF 的正常表达可能抑制膀胱癌细胞的生长、增殖,PEDF 有可能成为膀胱癌生物学治疗的一种有效的新方法;目前国内、外尚未见此项讨论的相关报道;因此我们设想,扩大样本量,应用分子生物学技术检测膀胱癌组织及非癌膀胱组织中PEDF 的表达水平,进一步讨论 PEDF 在膀胱癌中的表达情形,并结合临床资料分析 PEDF 表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后的关系;通过讨论膀胱癌组织中 PEDF 与 VEGF 表达的相关性,PEDF 与血小板反应素-1 表达的相关性,探讨膀癌组织中 PEDF 表达与肿瘤血管形成的相关性及可能的作用机制;通过讨论 PED
8、F 表达与金属蛋白酶 -9(MMP-9 )的相关性,探讨 PEDF 表达与膀胱癌浸润的相关性;通过讨论 PEDF 表达与已知的对肿瘤生长有明确调剂作用的肿瘤坏死因子( TNF- )、白细胞介素 1 ( IL-1 )、血栓调剂蛋白(thrombomodulin )和白介素 8( IL-8 )等细胞因子表达的相关性,探讨 PEDF 表达对膀癌细胞调剂的可能机制,从而探讨 PEDF 在膀胱癌发生、进展过程中的可能作用机制;在此基础上,以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型,进一步探讨 PEDF 表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗成
9、效 参考文献,为膀胱癌的生物学治疗探究一种有效的新方法;名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2 吴阶平,吴阶平泌尿外科学,山东科学技术出版社,2004.5:898-917 二、讨论内容和技术关键 讨论的总体目标:1 讨论 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系,探讨 PEDF 表达在膀胱癌 发生、进展及转移过程中可能的作用机制;2 讨论 PEDF 对膀胱癌细胞的治疗成效,为临床治疗膀胱癌的生物治疗探究一种新的有效方法 讨论的创新点:本课题讨论的内容和思路不同于以往的其他讨论,应用分子生物学方法从讨论
10、 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系入手,探讨PEDF 表达在膀胱癌发生、进展和转移中可能的作用机制;在此基础上,以连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以 PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型,探讨 PEDF 对膀胱癌的治疗作用;目前,本项讨论国内、外尚未见报道;本讨论的顺当完成,将为膀胱癌的生物学行为的讨论开创了新的途径,也将为膀胱癌的生物学治疗探究一种新的有效方法;讨论的主要内容:1 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF 和相关细胞因子表达的检测及相关性讨论:应用分子生物学技术讨论膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF 表达状况,并检测VEGF 、TSP-
11、1、MMP-9 、TNF- 、 IL-1 、血栓调剂蛋白(测膀胱癌组织和非癌膀胱组织中的微血管密度thrombomodulin )和 IL-8 的表达状况;采纳免疫组化技术检(microvascular density ,MVD ),分析 PEDF 与 VEGF 、TSP-1、MMP-9 、TNF- 、 IL-1 、血栓调剂蛋白和 IL-8 表达的相关性,PEDF 与 MVD 的相关性;并结合临床资料分析讨论 PEDF 表达与膀胱癌患者 5 年生存率之间的关系;阐明 PEDF 表达与膀胱癌的发生、分期、分级、转移及预后的关系,探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、进展中的可能机制;2 PEDF 对
12、膀胱癌细胞株的治疗:以连接有PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对比,观看检测 VEGF 、TNF- 的表达情形及膀胱癌细胞的凋亡、增殖情形;3 PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗:名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型;以PEDF 蛋白(购自吉泰生物科技有限公司)直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组,以未注射 PEDF 组为阴性对比组; 观看各组的 MVD 、VEGF 及肿瘤增殖情形,探讨 PEDF 表达在膀胱癌发生、进展中的作用机制
13、,评估 PEDF 对膀胱癌的治疗成效,为进一步过度到临床应用供应依据;需要解决的技术关键:1 连接有 PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染胜利率;2 PEDF 定量检测:我们已有对前列腺癌、肾癌、膀胱癌等组织标本的 PEDF 定量分析的基础,已形成较成熟技术条件、设备和讨论体会;3 膀胱癌裸鼠模型的构建;我们已有胜利构建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的体会;讨论方法:方法( 1)膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和相关细胞因子表达的检测及相关性讨论:试验组对比组PEDF膀胱癌组织非癌膀胱组织标本B 期癌旁膀胱组正常膀胱组炎性膀胱组A期C期D期例数30 30 30 30 织织织120
14、120 120 real-time PCR)技术 , 对膀胱癌、非癌膀胱组织中 应用 SYBR Green I 实时定量聚合酶链反应(进行定量测定; Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9; ELISA 法检测 TNF- 、IL-1 、血栓调剂蛋白、IL-8 浓度; 免疫组化方法检测标本 MVD; 整理临床资料:名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分级、是否转移、5 年生存率; 数据统计分析 使用 SPSS统计分析软件 :PEDF与 VEGF表达的相关性
15、;PEDF与 TSP-1 表达的相关性 PEDF与 MMP-9表达的相关性 IL-8 浓度的相关性;PEDF与 TNF- 、IL-1 、血栓调剂蛋白、PEDF与组织 MVD相关性;PEDF与膀胱癌分期的相关性;PEDF与膀胱癌恶性程度(分级)的相关性;PEDF与膀胱癌转移的相关性;PEDF与膀胱癌 5 年生存率的相关性;方法( 2)PEDF对膀胱癌细胞株的治疗:以连接有 PEDF编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞, 以空载转染膀胱癌细胞作为对比,检测 VEGF、TNF- 浓度,观看细胞的增殖、凋亡情形,分析相关性;以 RT- PCR 法扩增 PEDF基因;将扩增后的 PEDF基因连接入腺病毒载
16、体,转染膀胱癌细胞;并以空载转 染为对比; Western blot 法检测 VEGF 、TSP-1、MMP-9表达;观看膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡情形;统计分析;方法( 3)PEDF对裸鼠膀胱癌模型的治疗:以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型;以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作为治疗组,以未注射PEDF为阴性对比组;观看两组膀胱癌组织MVD、VEGF表达情形、肿瘤增殖情形,评价 PEDF 对膀胱癌的治疗成效; 以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型;名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 将 P
17、EDF蛋白注射于裸鼠瘤体内; 应用免疫组化方法检测 MVD;应用 Western blot 法检测 VEGF、TSP-1、MMP-9;观看肿瘤增殖、凋亡情形;分析 PEDF与 VEGF的相互作用关系及其对肿瘤生长的作用机制;技术路线:1 膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF及相关细胞因子表达的检测及相关性讨论:膀胱癌标本PEDF 癌旁膀胱组织标正常膀胱组织标炎性膀胱组织标RT-PCR检 测Western blotELISA 法检测 TNF-免疫组化方法检测法检测 VEGF、mRNA 表达 、IL-1 、血栓调标本微血管密度结合临床资料,数据统计分析2 PEDF 对膀胱癌细胞株的治疗:将 PEDF
18、转染膀胱癌细胞株,检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF- 浓度,观看肿瘤细胞的增殖、凋亡名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - RT PCR法扩增 PEDF基因空载体 连接入腺病毒载体转染膀胱癌细胞株Western blot 法检ELISA法检观看细胞凋情形;测 VEGF 、TSP-1、测 TNF-亡、增殖情结果分析3 PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗:观看 PEDF与 VEGF、MVD相关性及其对膀胱癌细胞的抑制作用构建膀胱癌裸鼠模型注射 PEDF 蛋白 未注射(对比)观看微血 VEGF、TSP-1、肿瘤凋亡、增
19、管密度MMP-9定量测殖、侵袭情形结果分析先后开展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基础讨论(包括分子生物学讨论)和临床讨论,如:裸名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 鼠膀胱癌模型的建立、CD44 基因、端粒酶、P53 和 Ras 基因等表达与膀胱癌的关系、VEGF 表达与膀胱癌的关系等, 娴熟把握了泌尿生殖系统肿瘤分子生物学和细胞学讨论的技术方法,如 RT-PCR、southern 、northern 杂交、 DNA 测序、拥有独立的泌尿外科免疫、病理、分子生物学和细胞学试验室,试验室设备完善,技术方法先进,拥有 PCR-
20、扩增仪、酶标仪、各种电泳槽、凝胶成像设备、细胞房及各种基础试验设备等 ,为本课题的顺当进行供应了有力的技术和仪器设备保证;细胞培育、腺病毒载体构建等技术,积累了较丰富的讨论体会;最近我们开展了对膀胱癌、前列腺癌组织中PDEF 表达的初步讨论,把握了对肿瘤组织包括膀胱癌组织中 PDEF 表达的检测方法,对本课题的顺当进行供应了便利条件;例如:已完成对膀胱肿瘤与正常膀胱组织 PEDF 表达情形的对比性讨论,初步结果显示如下 : 1 定量 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果可见:PEDF 在正常膀胱组织中高表达 , 而在膀胱癌组织中表达明显降低(见图 1);2注:N1,N2 ,N3 :正常膀胱组织T1,
21、T2, T3:膀胱癌组织GAPDH :内参照M :为标记分子量图 1:正常膀胱组织与膀胱癌组织 PEDF 定量 PCR2在膀胱癌组织中PEDF 低表达与微血管增殖相关(见图2);预期成果:(1)明确测定出 PEDF 在膀胱癌中的表达情形以及其与相关细胞因子表达之间的关系;(2)PEDF 在膀胱癌发生、进展过程中起重要作用;(3)PEDF 对膀胱癌的治疗有效,为最终过渡到临床应用供应强有力的试验依据;名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 成果以论文的形式表达,并申请“PEDF 治疗裸鼠膀胱癌模型技术” 的专利;拟发表论著5
22、7 篇,其中国内权威杂志 45 篇, SCI 收录杂志 2 篇;申请成果鉴定;本课题实施过程中,形成一整套的细胞因子检测方法、膀胱癌细胞株培育及腺病毒转染膀胱癌细胞技术、裸鼠膀胱癌模型的建立及 PEDF 治疗裸鼠膀胱癌模型等方法,将为复旦高校泌尿外科讨论所的分子生物学试验室和细胞学试验室供应新的讨论条件和技术,并为以后此类讨论的开展奠定扎实基础;本课题讨论过程中,拟培育硕士讨论生2 名,博士讨论生2 名,技术员一名;六、预期成效和风险分析 课题成果对社会进展所起的作用;经济效益和产业化前景(估计年产值、年利润、年节汇、年创汇、年节能等) ;对环境影响程度及资源综合利用情形;可能的技术风险;可能
23、的市场风险;本课题通过对对膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF 表达和相关细胞因子的检测,探讨PEDF 表达对膀癌细胞调剂的可能机制,从而探讨PEDF 在膀胱癌发生、进展过程中的可能作用机制;在此基础上,以连接有PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF 蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型,进一步探讨 PEDF 表达对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌的治疗成效;本课题的的顺当完成,不仅为膀胱癌发病机制的讨论供应了新的线索,而且,为膀胱癌的生物学治疗探究了一种有效的新方法,并为最终过渡到临床应用供应强有力的试验依据,具有较好的经济效益和社会效益;本课题的进行不会造成对环境的污染,并充分利用现有的综合资源包括:泌尿外科讨论所的的试验室、仪器设备、已积存的组织标本和病例资料、已经进行的与本课题有关的预试验基础等;可能的技术风险主要是:连接有PEDF 编码基因的腺病毒载体转染膀胱癌细胞株的转染胜利率和PEDF 对裸鼠膀胱癌模型的治疗成效;名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 9 页
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