医院病理科分子病理实验室实施方案.doc
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1、SEEPOO TECH*医院病理科分子病理实验室推荐方案目录第一部分 分子病理概述31.1分子病理诊断的应用范围51.2常用分子病理技术51.3 FISH-荧光原位杂交61.4部分FISH产品对比(厂家提供,仅供参考)71.5实时荧光定量PCR91.6 基因测序10第二部分 分子病理实验室设施与环境11第三部分 病理科实验室质量管理标准12第四部分 分子病理常用检测设备131、荧光显微镜原位杂交图像分析系统132、Leica Bond-Max全自动免疫组化和原位杂交多功能染色机133、罗氏LightCycler 480 模块式高通量实时荧光定量PCR系统144、罗氏BenchMark GX 全
2、自动多功能组织病理检测系统155、Illumina HiSeq 2000高通量测序仪156、NatureGene TermoBrite 原位杂交仪167、力康HFsafe-1200 Class Type A2 生物安全柜178、Neofuge1600 Healforce 台式高速冷冻大容量离心机18第五部分 分子病理实验室推荐设备型号及预算19方案一 初级配置方案19方案二 专业性配置方案19方案三 科研型配置方案20第六部分 分子病理常用试剂及价格20第七部分 分子病理经济效益分析257.1荧光原位杂交(FISH)检测项目的经济价值257.2 实时荧光定量PCR项目的经济价值27第一部分 分
3、子病理概述病理为医之本 As is our pathology, so is our medicine器官病理学组织细胞病理学临床病理免疫组化分子病理18-19世纪19世纪19世纪中叶取活体病变组织做病检提高病理诊断准确性20世纪早期诊断、靶向治疗20世纪手术切除组织标本病理检测病理学发展过程分子病理学中常用的分子生物学技术主要有核酸分子杂交、PCR相关技术、免疫荧光化学、基因芯片以及DNA序列分析等。由于分子病理学的应用,使得我们对疾病本质的认识更加深化,对于肿瘤的诊断和治疗也取得很大的进展。主要表现在以下几个方面:1、肿瘤易感基因的检测:肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有
4、实用价值,已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有Rb1(视网膜母细胞瘤)、WT1(肾母细胞瘤)等。除了检测高危人群的易感基因外,有方法也应用于正常人群肿瘤易感性检测,如检测Ret基因突变用于诊断型多发性内分泌肿瘤,通过分析GST基因型以判断个体暴露于致癌物时的致癌危险性等。2、肿瘤相关病毒的检测:如HPV病毒与宫颈癌的发生有很大关系,通过对HPV病毒的检测可起到预防和提早治疗的作用。而当前国际上诊断HPV感染以DNA检测为主。3、肿瘤的早期诊断:K-ras基因突变在结肠癌、胰腺癌和肺癌等肿瘤中发生率较高。应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌的第12密码子变突。应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中
5、的Ras基因突变,其检出率与瘤组织中相似,可用于高危人群的筛选。4、疑难肿瘤的诊断和分类:传统的病理学诊断主要通过形态学和免疫表型来判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤,但对对医生的经验要求较高,且难度较大。应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排,具有鉴别诊断作用,且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。对Bcr区基因重排的检测,可对慢性粒细胞性白血病和急性粒细胞性白血病进行鉴别诊断。N-myc和C-myc扩增和表达的检测,对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值,因前者N-myc明显扩增,而后者则为C-myc明显扩增。 5、肿瘤的预后监测:利用癌症患者的全基因序列开发出的个性化血液检测
6、方法有助于医生调整癌症患者的治疗方案,可以监测癌症治疗后的情况以及发现癌症是否复发。6、为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据:肿瘤在发生、发展的不同时期,可能涉及不同基因的不同变化形式,而这种变化与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关,如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标,对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活,50%左右的肿瘤有P53基因不同形式的突变,这些基因的异常,使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性,如能从基因水平上改变异常基因的状态,则可提高放、化疗的敏感性。 7、肿瘤的预后判断:肿瘤基因的突变、扩增及过表达等改变
7、常与肿瘤的预后密切相关。如HER2基因扩增与乳腺癌发生发展及临床预后密切相关, HER2的阳性表达提示预后不良,可通过荧光原位杂交(FISH)技术进行检测,配合术后治疗,指导临床用药。组织病理学诊断免疫病理学诊断分子病理学诊断病理学诊断及鉴别诊断肿瘤“个体化”靶向治疗断药物疗效的评价临床预后评估及预测1.1分子病理诊断的应用范围n 人类遗传病的基因诊断和产前诊断 n 肿瘤分子靶向治疗 n 明确感染性疾病的病源体(细胞、真菌、病毒) n 多基因病研究 n 组织器官移植配型 n 辅助病理诊断 n 法医学 n 性别鉴定 n 基础研究通过PCR技术确认Ig和TCR基因是否发生重排,判定淋巴造血系统疾病
8、的良恶性。FISH法检测乳腺癌her-2基因是否发生扩增,指导临床靶向药物(赫赛汀)治疗。FISH法检测滑膜肉瘤SYT基因是否发生易位,协助临床诊断。通过对结直肠癌KRAS基因的突变测序分析,指导靶向用药(爱比妥)。HPV多亚型检测,提示宫颈癌的发病风险。肺癌分子靶向治疗 EGFR酪氨酸激酶抑制剂:吉非替尼(gefitinib, 商品名Iressa) 、埃罗替尼 (Erlotinib, 商品名Tarceva)检测HER2状态的临床价值胃癌靶向治疗患者筛选、疗效预测 1.2常用分子病理技术免疫组织化学(IHC)技术检测蛋白 分子原位杂交DNA,RNA 荧光原位杂交(FISH)技术DNA,RNA多
9、聚酶链式反应PCR技术DNA,RNA 荧光定量PCRDNA,RNADNA测序技术DNA突变 生物芯片技术DNA,RNA,蛋白质等DNA印迹(Southern blot)微卫星不稳定检测(MSI) 医院病理科开展分子病理实验项目,一般从实用出发,二级医院主要开展荧光原位杂交(FISH)项目,三级医院主要开展荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR项目,有条件的三级医院可以开展DNA基因测序项目。1.3 FISH-荧光原位杂交FISH技术是一种通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交,在荧光显微镜下能原位显示细胞核内杂交信号的分子细胞遗传学技术。FISH技术检测基因扩增的准确性比其他检
10、测技术高,可以避免由于染色体的多体而呈现的假阳性,被誉为“金标准”。实验流程 FISH样本的制备-探针的制备-探针标记-杂交-(染色体显带)-荧光显微镜检测-结果分析FISH优点1.荧光探针商业化、采购方便、保存安全。2.实验周期短、特异性好、定位准确。3.可定位1KB的DNA序列,灵敏度高4.一次染色可获取24种不同颜色的染色体,对于隐匿性的缺失、异位诊断准确。FISH技术在医院的运用 一切与染色体相关的科室。特别是病理科、血液科、妇产科、生殖中心(产前诊断、植入前诊断)等。目前应用于临床检测的FISH基因探针有接近于一百种。在美国,FISH探针已被FDA列为“特异性分析试剂”,不需批准即可
11、用于临床医学检测。所以,FISH检测在国外应用非常广泛和迅速。如Vysis、Cytocell等公司,其产品已遍布全球,但其价格较贵,严重阻碍了在我国国内的推广。国内厂家,如金菩嘉和广州安必平,近年来发展迅速,品种覆盖范围较广,且产品质量保证、性价比高。并且,更为有利的是,国内公司供货快速及时、售后服务好。由于国内厂家的崛起,近年来国内医院开展FISH检测的速度大大加快。FISH技术实验室基本要求实验室环境:样本准备区、暗室(10-15平米左右);实验设备:荧光显微镜以及荧光成像分析系统、水浴锅、原位杂交仪、冰箱、离心机、恒温箱办公设备:电脑、打印机实验耗材:FISH探针,进口如雅培、罗氏 细胞
12、类探针:诸如血液病类,如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。其次,产前诊断和产后筛查类;实体肿瘤类探针:病理科在检测乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、软组织肉瘤、前列腺癌、甲状腺癌等方面。技术人员:1人1.4部分FISH产品对比(厂家提供,仅供参考)品牌比较广州安必平金菩嘉雅培(Vysis)探针种类覆盖70种肿瘤探针,品种齐全,覆盖了实体瘤及血液疾病。约40种,部分肿瘤没有覆盖。覆盖70种肿瘤探针,品种齐全,覆盖了实体瘤及血液疾病。探针质量用多个克隆标记探针,信号灵敏,背景低,质量与国外相当。实体瘤探针质量与国外相当,但血液病探针信号不佳。探针信号灵敏,背景低,质量好。价格由于有自己的研发团队,探
13、针都为自产,成本较低,具有强大的价格竞争力,本公司的出现也打破了国内公司一家独大的垄断。价格比雅培低,但高于安必平。由于异国操作,运营成本高,价格高。操作便利性即用型探针:探针溶液已包含杂交液组分,可直接点样杂交,无需杂交前溶解探针和混匀探针及杂交液,方便操作和减少出错。探针与杂交液分开,杂交前需在黑暗环境中混合两者,操作不变、容易出错。探针与杂交液分开,杂交前需在黑暗环境中混合两者,操作不变、容易出错。辅助试剂配送FISH所需的常规试剂(蛋白酶K或胃蛋白酶、NP-40、多聚甲醛、20SSC等),节约客户采购时间及成本。搭配蛋白酶K一起销售。搭配蛋白酶K、NP-40等一起销售。荧光显微系统配置
14、从客户出发,帮客户选用性价比高的荧光显微镜及图像分析软件,操作便利,性价比高。满足要求,但价格较高。满足要求,但价格较高,且客户可能需自己配置系统。显微镜明场观察配相差功能,可镜下仔细观察蛋白酶消化状态,对小体积样本及珍贵样本处理特别有效,避免消化不佳导致杂交结果不好。不配相差功能。不配相差功能。标配滤块对新客户标配四种颜色的荧光滤块(DAPI、绿、红、青),可同时满足实体瘤及产前诊断。只标配三种颜色滤块(DAPI、绿、红),如需开展产前诊断的话客户还要额外购买青色滤块。只标配三种颜色滤块(DAPI、绿、红);如需开展产前诊断的话客户还要额外购买青色滤块,且需用到金色滤块(容易出现窜色),滤块
15、配置要求太高。检测靶标因为标配了四种滤块,可同时检测三个靶标(绿红青),临床检测效率高、能降低试剂成本、且能应用于多靶标检测的科研课题。只有两个靶标的试剂(绿红),靶向选择及组合受限。有同时检测三个靶标的试剂,但因为不是标配,应用受限。图像分析软件有自主研发的图像分析软件,降低客户采购成本。外购。外购。品种设计因为所有探针都为自主研发,可为客户灵活设计产品探针组成,以便临床、科研充分使用及降低试剂成本探针不能根据客户需求进行调整,可能存在试剂成本较高的风险。探针不能根据客户需求进行调整,可能存在试剂成本较高的风险。特色产品能设计多个“二合一”探针组合;15种微缺失探针(用于流产原因筛查及其他少
16、见综合症);只有部分基因探针。不能根据客户需求设计“二合一”探针。国内SFDA证书两个产品取得注册受理号,即将取得注册证书。几个产品取得注册证书。两个产品取得注册证书。地理位置位于广州,华南地区客户地理位置近,送货及服务及时到位。位于北京,华南地区服务不便。位于国外,国内虽有代理,但售后服务及技术支持不能最快反应。平台支持有多年其他产品的网络支持,如病理科中的液基细胞学平台,与客户建立了多年来的良好关系。产品单一,只有FISH试剂,设备、人员投入高。有其他试剂,但病理科中只有FISH,无其他平台支持。售后服务借助于广泛的液基细胞学网络及合作公司达安基因的全国网络,售后服务迅速周到。售后服务网络
17、单一,售后服务风险较高。售后服务网络单一,售后服务风险较高。优势资源与达安基因合资,充分利用全国广泛的销售及技术支持资源。特殊资源有自己的学术核心期刊分子诊断与治疗,方便客户课题研究。无无1.5实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。临床疾病诊断:各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。实时荧光定量PCR分子病理诊
18、断应用 绝对定量(Absolute Quantification) 病原体检测(HiV,HBV,结核杆菌,H1N1等) 基因表达研究(白血病融合基因表达检测) 相对定量(Relative Quantification) 肿瘤组织中的特定基因表达(EGFR,VEGFR,BRCA1&2,ERCC1&2,RRM1) 肿瘤Bio-Marker特定miRNA检测1900多个试剂盒 CNV研究超过160万个TaqMan Copy Numer Assay 药物疗效考核 突变分型(Allelic Discrimination) 基因突变分析-肿瘤个体化医疗 SNP研究2600 个药物代谢试剂盒,个体化医疗 物
19、种鉴定、菌株鉴定 阴阳性检验(Plus/Minus with IPC) 稀有突变检测(早期肿瘤诊断:外周血痕量肿瘤细胞等荧光定量PCR显著优点 (1)、可以进行准确的定量检测,可适用于基因诊断的各种疾病; (2)、定量范围极宽,样品无需做梯度稀释; (3)、特异性更强,克服了假阳性的主要来源; (4)、操作快速,无需PCR后处理; (5)、技术简单,易于学习和掌握; (6)、安全,对操作员和环境都无危害。 (7)、易于进行电脑化操作和数据管理,有利于医院的现代化建设。实时荧光定量PCR检测肿瘤的有关项目 CEA mRNA、 AFP mRNA、uPA mRNA、CK19 mRNA、CK20 mR
20、NA、 MDRI mRNA。1.6 基因测序DNA 测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以 DNA 单链为模板,在特定条件下,用特异的引物在测序级 DNA 聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3- 羟基末端并使引物链得到延伸。将测序结果用DNA sequencing analysis 5.1软件自动分析原始测序数据,获取测序电泳图和序列图。临床基因测序检测对病理科的形态诊断金标准含金量的提升和分子病理技术的开发及经济效益改善有现实意义。对于可疑癌前病变患者可以明确其病变标本是否真正含有候选基因的突变,以解除大量由免疫组化标
21、记癌基因阳性患者的心理恐慌和经济负担。对癌症家族有血缘关系的亲属检测相关癌基因突变或多态性,具有亚健康诊断和体检意义。第二部分 分子病理实验室设施与环境1、布局合理、实验室各区域的划分;2、水电、照明、通风符合实验室基本要求;3、消防设施齐全、消防通道畅通;4、石蜡组织、DNA样本的存放;5、实验室记录、操作手册等文件存放;6、实验室耗材、试剂的存放;7、安装生物安全防护设施;8、废弃物的处置9、实验室的清洁与日常消毒、并有相关记录其中:PCR实验环境要求明确分区,一般分为4个工作区;各区独立,互不相通;设置缓冲间,设置传递窗;单一方向FISH实验环境要求:需要避光独立的暗室,专门的荧光显微镜
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- 医院 理科 分子 病理 实验室 实施方案
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