生物制药(四).ppt
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1、生物制药(四)Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望国际酶工程学会(国际酶工程学会(19711971年)定义:年)定义:酶工程酶工程是研究和开发酶的生产、酶是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学。工程科学。酶工程制药主要包括药用酶的生产和酶工程制药主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。酶法制药两方面的技术。药用酶是指可用于
2、预防和治疗疾病的酶。药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。酶法制药是指利用酶的催化作用酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术而制造出具有药用功效的物质的技术过程过程.药用酶:药用酶:酶法制药:酶法制药:第一节第一节 概述概述 酶是生物催化剂。是由活细胞酶是生物催化剂。是由活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂,它能催化各种生物化学反催化剂,它能催化各种生物化学反应。应。一、酶的催化特性一、酶的催化特性催化剂的共同点催化剂的共同点量少高效;量少高效;只加速可逆反应的进程,而不改变反应只加速可逆反应的进程,而不改变反应的平衡点。的平衡点。都是通
3、过降低反应分子的活化能来加快都是通过降低反应分子的活化能来加快化学反应的速度。化学反应的速度。酶的特性酶的特性高效催化高效催化高度专一高度专一条件温和条件温和1 1、酶的专一性强、酶的专一性强 酶的专一性酶的专一性(specificity):是是指一种酶只能催化一种或一类结指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反构相似的底物进行某种类型的反应。应。绝对专一性绝对专一性(absolute specificity):只能只能作用于特定结构的底物,进行一种专一的作用于特定结构的底物,进行一种专一的反应,生成一种特定结构的产物反应,生成一种特定结构的产物 。立体结构特异性立体结构特异性
4、(stereo specificity):作用于立体异作用于立体异构体中的一种。构体中的一种。相对专一性相对专一性(relative specificity):作用作用于一类化合物或一种化学键。于一类化合物或一种化学键。根据酶对其底物结构选择的严格程度不同,根据酶对其底物结构选择的严格程度不同,酶的专一性可大致分为以下酶的专一性可大致分为以下2 2种类型:种类型:2 2、酶的催化效率高、酶的催化效率高 酶的催化效率通常比非催化反应高酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍,比一般催化剂高倍,比一般催化剂高1071013倍。倍。酶酶和和一一般般催催化化剂剂加加速速反反应应的的机机理理都都是
5、是降降低低反反应应的的活活化化能能(activation energy)。酶酶比比一一般般催催化剂更有效地降低反应的活化能。化剂更有效地降低反应的活化能。3 3、酶的作用条件温和、酶的作用条件温和 酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化作用一般都在常温、常压、酶的催化作用一般都在常温、常压、pHpH近乎中性的温和条件下进行,不需高近乎中性的温和条件下进行,不需高温高压和极端温高压和极端pHpH条件。条件。二、影响酶催化作用的主要因素二、影响酶催化作用的主要因素1 1、酶浓度对酶促反应的影响、酶浓度对酶促反应的影响在有在有足够底物足够底物和其他条件不变的情况下:和其
6、他条件不变的情况下:v=k E酶促反应的速度与酶浓度成正比酶促反应的速度与酶浓度成正比2 2、底物浓度对酶促反应的影响、底物浓度对酶促反应的影响 S S v vV Vmma ax x一级反应一级反应一级反应一级反应 v=k v=k v=k v=k SSSS零级反应零级反应零级反应零级反应 v=kv=kv=kv=k E E E E混合级反应混合级反应当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比;反反应速度与底物浓度成正比;反应为一级反应。应为一级反应。SSV VVmaxVmax随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速;反应反应速度不再成正比例加速;反应为混合级反应
7、。为混合级反应。SSV VVmaxVmax当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加,达最大速度;反应速度不再增加,达最大速度;反应为零级反应反应为零级反应SSV VVmaxVmax3 3、pHpH对酶促反应的影响对酶促反应的影响1.最适pH 2.有效pH表现出酶最大活力的pH值在一定的pH范围内酶是稳定的pH对酶作用的影响机制对酶作用的影响机制:1.环境过酸、过碱使酶变性失活;2.影响酶活性基团的解离;3.影响底物的解离。0酶酶活活性性pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶 246810q
8、双重影响双重影响温温度度升升高高,酶酶促促反反应应速速度度升升高高;由由于于酶酶的的本本质质是是蛋蛋白白质质,温温度度升升高高,可可引引起起酶酶的的变变性性,从从而反应速度降低而反应速度降低 。4 4、温度对酶促反应的影响、温度对酶促反应的影响q最适温度最适温度 (optimum temperature):酶促反应速度最快时的酶促反应速度最快时的环境温度。其不是酶的特征环境温度。其不是酶的特征性常数性常数酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 5 5、激活剂对酶促反应的影响、激活剂对酶促反应的影响激
9、活剂激活剂使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如:Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等;无机离子对酶的激活作用:无机离子对酶的激活作用:(1 1)与酶分子肽链上的侧链基团相结合,稳定酶)与酶分子肽链上的侧链基团相结合,稳定酶催化作用所需的构象。催化作用所需的构象。(2 2)作为底物与酶蛋白之间联系的桥梁。)作为底物与酶蛋白之间联系的桥梁。(3 3)可能作为辅酶或辅基的一个组成部分,协助)可能作为辅酶或辅
10、基的一个组成部分,协助酶的催化作用。酶的催化作用。使用激活剂注意使用激活剂注意激活剂对酶的作用具有一定的选择性,激活剂对酶的作用具有一定的选择性,使用不当,会适得其反,激活剂之间有使用不当,会适得其反,激活剂之间有时存在拮抗现象。时存在拮抗现象。激活剂的浓度有一定的范围,超出此范激活剂的浓度有一定的范围,超出此范围,会得到相反的效果。围,会得到相反的效果。6 6、抑制剂对酶促反应的影响、抑制剂对酶促反应的影响使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质,称为抑制剂(I)。(1 1).不可逆抑制作用不可逆抑制作用不可逆抑制作用不可逆抑制作用:抑制剂与酶的结合(共价
11、键)是:抑制剂与酶的结合(共价键)是:抑制剂与酶的结合(共价键)是:抑制剂与酶的结合(共价键)是不可逆的。不可逆的。不可逆的。不可逆的。S +EESE+P+IEIESH+ICH2COOH ESCH2COOH+HI 抑制抑制抑制抑制作用作用作用作用特点:不可逆性抑制,抑制剂浓度越高,特点:不可逆性抑制,抑制剂浓度越高,特点:不可逆性抑制,抑制剂浓度越高,特点:不可逆性抑制,抑制剂浓度越高,抑制抑制抑制抑制作用作用作用作用时间越长,抑制时间越长,抑制时间越长,抑制时间越长,抑制作用作用作用作用越强。越强。越强。越强。(2)可逆抑制作用)可逆抑制作用:抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制程度是由酶与抑制剂
12、之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。Ev1231.反应体系中不加反应体系中不加I。2.反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。量的不可逆抑制剂。3.反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。量的可逆抑制剂。Ev不可逆抑制剂的作用Ev 可逆抑制剂的作用I I 竞争性抑制作用竞争性抑制作用竞争性抑制作用竞争性抑制作用:抑制剂和底物竞争与酶结合。:抑制剂和底物竞争与酶结合。:抑制剂和底物竞争与酶结合。:抑制剂和底物竞争与酶结合。特点特点特点特点:1 1)抑制剂和底物竞争酶的结合部位。)抑制剂和底物竞争酶的结合部位。)抑制剂和底物竞争酶的结合部位。)抑制剂和底物竞
13、争酶的结合部位。2 2)抑制程度取决于)抑制程度取决于)抑制程度取决于)抑制程度取决于I I和和和和S S的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的 亲和力大小。亲和力大小。亲和力大小。亲和力大小。3 3)竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。)竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。)竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。)竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。S +EESE+P+IEI非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用:底物和抑制剂同时与酶结合,:底物和抑制剂同时与酶结合,:底物和抑制剂同时与酶结合,:底物和抑制剂同时与酶结
14、合,但形成的但形成的但形成的但形成的EISEIS不能进一步转变为产物。不能进一步转变为产物。不能进一步转变为产物。不能进一步转变为产物。S +EESE+P+IEI+IEIS+SE+P特点特点特点特点:1 1)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度II的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。2 2)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。3 3 3 3)抑制剂不改变酶对底物的亲和力。)抑制剂不改变酶对底物的亲和力。)
15、抑制剂不改变酶对底物的亲和力。)抑制剂不改变酶对底物的亲和力。反竞争性抑制作用:反竞争性抑制作用:反竞争性抑制作用:反竞争性抑制作用:I I与酶和底物的中间复合与酶和底物的中间复合与酶和底物的中间复合与酶和底物的中间复合物结合而不与游离酶结合,从而抑制酶活性。物结合而不与游离酶结合,从而抑制酶活性。物结合而不与游离酶结合,从而抑制酶活性。物结合而不与游离酶结合,从而抑制酶活性。S +EESE+P +IEISE+P特点特点特点特点:1 1)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度)随着抑制剂浓度II的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。的增加,抑制作用增强。2
16、2)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。)底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。3 3 3 3)抑制不改变酶对底物的亲和力。)抑制不改变酶对底物的亲和力。)抑制不改变酶对底物的亲和力。)抑制不改变酶对底物的亲和力。三、酶的分类与命名三、酶的分类与命名(一)、酶的命名(一)、酶的命名1、习惯名:命名原则如下、习惯名:命名原则如下(1.)根据酶的底物命名。)根据酶的底物命名。(2.)根据所催化的反应的性质命名。)根据所催化的反应的性质命名。(3.)有的酶结合上述两个原则命名。)有的酶结合上述两个原则命名。(4.)在这些基础上
17、有时还加上酶的来源或酶)在这些基础上有时还加上酶的来源或酶的其它特点。的其它特点。2、系统名:要求能确切表明底物的化学本质、系统名:要求能确切表明底物的化学本质及酶的性质,包括两部分,即底物名称及反及酶的性质,包括两部分,即底物名称及反应类型,底物间用应类型,底物间用“:”分开,若底物之一分开,若底物之一是水则可略去不写。是水则可略去不写。ATP+CH3COOH ADP+CH3CO P其系统名为:ATP:乙酸磷酸转移酶(二)、酶的分类(二)、酶的分类根据反应性质分为六大类根据反应性质分为六大类1、氧化还原酶类:催化氧化还原反应,涉及、氧化还原酶类:催化氧化还原反应,涉及H 和电子的转移。如脱氢
18、酶类。和电子的转移。如脱氢酶类。2、转移酶类:催化分子间功能基团的转移。、转移酶类:催化分子间功能基团的转移。如转氨酶类。如转氨酶类。3水解酶类:催化水解反应。如蛋白酶、淀水解酶类:催化水解反应。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4裂合酶类:催化非水解地除去底物分子中裂合酶类:催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。如醛缩酶脱氨酶的基团及其逆反应的酶。如醛缩酶脱氨酶 脱脱羧酶羧酶5异构酶类:催化同分异构体的相互转变。异构酶类:催化同分异构体的相互转变。6、合成酶:与、合成酶:与ATP 分解相偶联,并由二种物分解相偶联,并由二种物质合成一种物质。如天冬酰胺合成酶
19、质合成一种物质。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸丙酮酸羧化酶羧化酶 在每一大类酶中,又根据底物中被作用的在每一大类酶中,又根据底物中被作用的基团或键的特点分为若干亚类,然后再把属基团或键的特点分为若干亚类,然后再把属于某一亚类、亚亚类的酶按顺序排好,这样于某一亚类、亚亚类的酶按顺序排好,这样把已知的酶分门别类地排成一个表,叫做酶把已知的酶分门别类地排成一个表,叫做酶表。表。类类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号如如如如 EC1.1.1.27 EC1.1.1.27 为乳酸:为乳酸:为乳酸:为乳酸:NADNAD+氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶 EC1.1.1.37 EC1.1.1.37 为苹果酸
20、:为苹果酸:为苹果酸:为苹果酸:NAD NAD+氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶 EC1.1.1.1 EC1.1.1.1 为乙醇:为乙醇:为乙醇:为乙醇:NAD NAD+氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶氧化还原酶一些酶的命名举例一些酶的命名举例四、酶活力及其测定四、酶活力及其测定 酶酶酶酶的的的的定定定定量量量量并并并并非非非非对对对对其其其其蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质进进进进行行行行定量,而是对它的定量,而是对它的定量,而是对它的定量,而是对它的催化能力催化能力催化能力催化能力进行定量。进行定量。进行定量。进行定量。所所所所所所以以以以以以,酶酶酶酶酶酶的的的的的的定定定定定定量量量量量
21、量就就就就就就是是是是是是测测测测测测定定定定定定酶酶酶酶酶酶的的的的的的活活活活活活力力力力力力,也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。1.1.酶活力酶活力及测定及测定 酶活力酶活力 是酶促反应的能力。酶活力是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢,即酶催化的反应速度越反应速度的快慢,即酶催化的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。酶活力测定酶活力测定 酶活力测定包括两个
22、阶段。首先要在一定酶活力测定包括两个阶段。首先要在一定条件下,将酶与其作用底物混合均匀,反应一条件下,将酶与其作用底物混合均匀,反应一段时间,然后再测定反应液中底物或产物变化段时间,然后再测定反应液中底物或产物变化的量。的量。步骤:步骤:(1 1 1 1)根据酶的专一性,选择适宜的底物,并配置成一定浓度的底物溶液。)根据酶的专一性,选择适宜的底物,并配置成一定浓度的底物溶液。)根据酶的专一性,选择适宜的底物,并配置成一定浓度的底物溶液。)根据酶的专一性,选择适宜的底物,并配置成一定浓度的底物溶液。(2 2 2 2)根据资料或试验结果,确定酶催化反应的温度、)根据资料或试验结果,确定酶催化反应的
23、温度、)根据资料或试验结果,确定酶催化反应的温度、)根据资料或试验结果,确定酶催化反应的温度、pHpHpHpH值等条件。值等条件。值等条件。值等条件。(3 3 3 3)在一定的条件下,将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀,记)在一定的条件下,将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀,记)在一定的条件下,将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀,记)在一定的条件下,将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀,记录开始的时间。录开始的时间。录开始的时间。录开始的时间。(4 4 4 4)反应到一定的时间,取出适量的反应液运用各种适合)反应到一定的时间,取出适量的反应液运用各种适合)反应到一定的时间
24、,取出适量的反应液运用各种适合)反应到一定的时间,取出适量的反应液运用各种适合的生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。的生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。的生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。的生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。反应时间一到,立即取出一定量的反应液,置于反应时间一到,立即取出一定量的反应液,置于反应时间一到,立即取出一定量的反应液,置于反应时间一到,立即取出一定量的反应液,置于沸水浴中,加热使酶失活。沸水浴中,加热使酶失活。沸水浴中,加热使酶失活。沸水浴中,加热使酶失活。立即加入适宜的酶变性剂,如三氯醋酸等,使酶立即加入适宜的酶变性剂,
25、如三氯醋酸等,使酶立即加入适宜的酶变性剂,如三氯醋酸等,使酶立即加入适宜的酶变性剂,如三氯醋酸等,使酶变性失活。变性失活。变性失活。变性失活。立即加入酸或碱溶液,使反应液的立即加入酸或碱溶液,使反应液的立即加入酸或碱溶液,使反应液的立即加入酸或碱溶液,使反应液的pHpHpHpH值迅速远离值迅速远离值迅速远离值迅速远离酶促反应的最适酶促反应的最适酶促反应的最适酶促反应的最适pHpHpHpH值,从而终止反应。值,从而终止反应。值,从而终止反应。值,从而终止反应。将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中,将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中,将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中,将取出的反应
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