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1、十二核酸的生物合成 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 主要内容一一 DNA的生物合成的生物合成二二 RNA的生物合成的生物合成中心法则中心法则(central dogma)复复制制:是亲代双链DNA按碱基配对原则,准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转转录录:是以一条DNA链为模板,将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻翻译译:是以mRNA为模板,将mRNA上的遗传信息
2、转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则中心法则:遗传信息由DNA mRNA Pro的流动途径。蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA中心法则中心法则:遗传信息由DNA mRNA Pro的流动途径。补充和完善之处:A:RNA作为遗传物质能自我复制,并作为mRNA指导Pro的合成。B:RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。DNA在复制时,两条在复制时,两条链解开分别作为模板,在链解开分别作为模板,在DNA聚合酶的催化下按碱聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模基互补的原则合成两条与模板链互补的新链,以组成新板链互补的新链,以组成新的的DNA分子。这样
3、新形成分子。这样新形成的两个的两个DNA分子与亲代分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全分子的碱基顺序完全一样。由于子代一样。由于子代DNA分子分子中一条链来自亲代,另一条中一条链来自亲代,另一条链是新合成的,这种复制方链是新合成的,这种复制方式称为半保留复制式称为半保留复制。一、一、DNA的生物合成的生物合成 (一)半保留复制(一)半保留复制 15N DNA14N-15N DNA14N DNA14N-15N DNA1958年年Meselson&stahl用同位素示踪用同位素示踪标记加密度梯度离标记加密度梯度离心技术心技术实验实验,证明证明了了DNA是采取半保是采取半保留的方式进行复制留的方式进行
4、复制.DNA的半保留复制实验依据 Meselson-stahl实验实验(a)密度梯度离心的密度梯度离心的DNA带带 (b)对应于左侧对应于左侧DNA带的解释带的解释(二)(二)DNA复制的起点和方向复制的起点和方向 复复制制叉叉(replication forks):复制中的DNA分子,未复制的部分是亲代双螺旋,而复制好的部分是分开的,由两个子代双螺旋组成,复制正在进行的部分叫做复制叉。细胞内存在着能识别起始点的特种Pr。方方向向:复制叉从起始点出发,沿DNA移动,移动方向与前导链的延长方向相同。复制可能是单向的,也可能是双向的,两个方向的复制速度不一定相同。大大多多数数是双向的。是双向的。眼
5、眼状状结结构构:线状DNA分子上的正在复制的部分形成;结构结构:环状DNA分子上的正在复制的部分形成。DNA的双向和单向复制的双向和单向复制环状环状 DNA复制时复制时所形成的所形成的Q结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制两种复制模式两种复制模式(a)单向复制模式单向复制模式(b)大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA双向复制模式双向复制模式单向复制单向复制i双向复制双向复制观察到的放射观察到的放射自显影图象自显影图象18%质粒ColE1的单向复制示意图单向复制单向复制
6、最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns(1963年)。型型DNA Replication 原核生物:只有一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开始复制。真核生物;可在DNA链上的多个不同位点同时起始复制。所以真核生物的DNA复制速度比原核生物快些。真核生物真核生物DNA的多起点复制的多起点复制(三)(三)DNA的复制过程(原核生物)的复制过程(原核生物)DNA的的合合成成是是以以四四种种脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸即即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为为前前体体,在在DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下,向向DNA的的3OH端端添添加加脱脱氧氧核核苷苷酸酸,在在DNA的的
7、3OH与与添添加加的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的5磷磷酰酰基基间间形形成成3,5磷磷酸酸二二酯酯键键,反反应应中中脱脱去去一一个焦磷酸基团。个焦磷酸基团。合成方向合成方向:5 3 添加到链上的每个核苷三磷酸是按照模板链的顺序由碱基互补配对原则选择的。反应的通式可写为:(NMP)n3OHdNTP (NMP)n13OHPPi 1、DNA聚合酶聚合酶 pol(1)具具5 3聚合酶活性聚合酶活性 将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐个添加到具有3OH末端的多核苷酸链上形成3,5磷酸二酯键。特点特点:A:底物为d NTP;B:DNA模板(3 5);C:引物:RNA引物(带3羟基);D:方向 5 3;F:产物DN
8、A的性质与模板相同 。DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应5RNA引物引物子链33553355335模板链 (2)具有具有3 5端核酸外切酶端核酸外切酶的活性的活性 有校对功能,能在3OH端将DNA链水解。以保证DNA复制的真实性。DNADNA聚合酶的聚合酶的3-5外切酶水解位点外切酶水解位点3355错配碱基错配碱基3-5核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点(3)具有具有5 3端核酸外切酶端核酸外切酶的活性的活性 由5端水解DNA链,主要是切去一小段DNA,包括RNA引物和损伤DNA部分。pol主要功能主要功能:用于修复DNA双螺旋区中的单链区,这些单链区是在DNA复制时或DNA
9、受损伤后留下的。活性高。活性高。DNA聚合酶聚合酶5-3外切酶活力外切酶活力5-3核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点单链缺口单链缺口5 2、DNA聚合酶聚合酶 pol 具有3 5端核酸外切酶的活性,主要负责DNA的修复,在一定程度上参与DNA复制。活活性性低低。功能不十分清楚,是一种修修复复酶酶。3、DNA聚合酶聚合酶 pol 是使DNA链延长的主要聚合酶,目前已知全酶是由7种多肽形成的复合物,含有10种共22个亚基组分(22222222222)和Zn原子。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶的结构和功能全酶的结构和功能 延长因子延长因子DNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住
10、DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体核心酶核心酶校对校对引物的结引物的结合和识别合和识别促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化(1)亚基:具5 3端聚合酶活性(需模板和引物);(2)亚基具3 5端核酸外切酶的活性。校对作用,以提高保真性;(3)、亚基相连形成核心酶pol,亚基起组建作用;(4)核心酶+亚基后成为二聚体,称为pol;(5)pol与、亚基结合,形成pol,、亚基可增强酶与模板的结合;(6)pol与亚基结合形成全酶,亚基犹如夹子,夹住DNA向前滑动,不脱离,提高持续合成能力。大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数
11、每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用聚合酶作用3-5 核酸核酸外切酶作用外切酶作用5-3 核酸核酸外切酶作用外切酶作用转化率转化率DNA聚合酶聚合酶109,000400+1120,000100+-0.05400,00010-20+-50比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶III切除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能 1999年发现聚合酶年发现聚合酶 和和,它们涉及,它们涉及DNA的错误倾向的错误倾向修复(修复(errooune repair)pol pol不是不是DNADNA复制酶复制酶,理由:,理由:A A、该该酶酶合合成成DNADNA速速度度太太慢慢,只只是是细细胞胞内内DNAD
12、NA复制速度的复制速度的1%1%;B B、持持续续合合成成能能力力较较低低,而而细细胞胞内内DNADNA复制不会频繁中止;复制不会频繁中止;C、许多基因突变都会影响许多基因突变都会影响DNA复制,复制,但都与但都与polpol无关。无关。3、双链、双链DNA复制的分子机制复制的分子机制(1)冈崎片段和半不连续复制)冈崎片段和半不连续复制不连续复制:不连续复制:3 5走向的走向的DNA实际上是由实际上是由许多许多5 3 方向合成的方向合成的DNA片段连接起来的。片段连接起来的。(已知(已知DNA聚合酶的合成方向都是聚合酶的合成方向都是5 3)在在一一个个复复制制叉叉内内两两条条链链的的复复制制方
13、方向向、合合成方式、复制速度是不同的。成方式、复制速度是不同的。前导链前导链(leading strand):以一条链(以一条链(3 5)为模板时,子代)为模板时,子代链的合成方向是链的合成方向是5 3,合成是连续的,合成是连续的,合成速度较快。合成速度较快。后随链后随链(lagging strand):以另一条亲代链(以另一条亲代链(5 3)为模板时,子代链的合成方向不能按照)为模板时,子代链的合成方向不能按照3 5方向进行,因为迄今没有发现这样的方向进行,因为迄今没有发现这样的DNA聚合聚合酶,因此只能合成方向为酶,因此只能合成方向为5 3方向的许多方向的许多DNA小片段(约小片段(约10
14、00-2000dp,7-10S),),为为1968年日本人冈崎等人发现,叫冈崎片段,然年日本人冈崎等人发现,叫冈崎片段,然后在后在DNA连接酶催化下,连接起来形成一条子代连接酶催化下,连接起来形成一条子代链。链。合成是不连续的,合成速度较慢。当一段新合成是不连续的,合成速度较慢。当一段新的冈崎片段合成后,的冈崎片段合成后,pol行使行使5 3核酸外切酶核酸外切酶活性切除引物,再合成一段活性切除引物,再合成一段DNA作为替换,缺口作为替换,缺口由由DAN连接酶封口。连接酶封口。(2)冈崎片段的冈崎片段的RNA引物引物 引引物物的的合合成成由由引引物物合合成成酶酶催催化化完完成成,这这些些酶酶在在
15、模模板板单单链链DNA上上识识别别特特殊殊序序列列,合合成成RNA引引物物。它它本本身身没没有有活活性性,需需要要与与“引引发发前前体体”结结合合在在一一起起,形形成成“引引发发体体”后后才才有有活活性性。引引发发体体在在复复制制叉叉上上移移动动,识识别别合合成成的的起起始始点点,引引发发RNA引物的合成,该过程需引物的合成,该过程需ATP提供能量。提供能量。方向方向:以:以DNA为模板,为模板,5 3长长度度:几几个个至至10个个核核苷苷酸酸,5端端含含3个个磷磷酸酸残残基,基,3端为游离羟基。端为游离羟基。DNA聚合酶聚合酶III:聚合脱氧核糖核苷酸:聚合脱氧核糖核苷酸引物消除和缺口填补引
16、物消除和缺口填补:DNA聚合酶聚合酶IDNA连接酶连接酶:将冈崎片段连成长链:将冈崎片段连成长链为为什什么么需需要要RNA引引物物、而而且且最最后后要要切切除除?1、DNA聚聚合合酶酶有有校校正正功功能能,每每引引入入一一个个核核苷苷酸酸都都要要复复查查一一次次,无无误误后后方方继继续续下下去去,它它不不能能从从无无到到有有合合成成新新的的链链,因因为为在在未未核核实实前前一一个个核核苷苷酸酸处处于于正正确确配配对对状状态态时时是是不不会会进进行行聚合反应的;聚合反应的;2、RNA引物是从新开始合成的,错配的引物是从新开始合成的,错配的可能性大,在完成引物功能后即将它删除,可能性大,在完成引物
17、功能后即将它删除,而代之以高保真的而代之以高保真的DNA链。链。解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物酶和引发引物酶和引发体体DNA聚合酶聚合酶ISSB335355RNA引物引物(3)DNA连接酶连接酶 催化子代双链DNA中的切口处的相邻3-OH和5-磷酰基之间形成磷酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链连接起来。同时该酶要求含有3-OH和5-磷酰基的DNA片段能以氢键与互补链结合。DNA3OHP5DNAATP(NAD+)DNA3OP5DNAAMPPPi(NMN)E,coli连接酶连接酶催化下的连接机制催化下的连接机制连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶
18、ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链模板链模板链(4)母本)母本DNA双链的分离双链的分离解螺旋酶解螺旋酶(helicase)使DNA双螺旋的两条链分开。条件条件:ATP提供能量,有单链DNA存在。后随链:解旋酶结合于它的模板上,移动方向是5 3前导链:另一种解旋酶叫rep蛋白,移动方向是3 5。单单链链结结合合蛋蛋白白(single-strand binding protein,SSB)结合在单链DNA分子上,功能是稳定已被解开的DNA单
19、链,阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。拓拓扑扑异异构构酶酶(DNA松松弛弛酶酶)(topoisomerase)涉及超螺旋的松弛,复制后又涉及到涉及超螺旋的松弛,复制后又涉及到它们的再次形成。它们的再次形成。正正超超螺螺旋旋(左左):双双螺螺旋旋DNA处处于于拧拧紧紧状状态时形成的超螺旋,使态时形成的超螺旋,使DNA解开双螺旋困难解开双螺旋困难 负超螺旋(右):双螺旋负超螺旋(右):双螺旋DNA处于拧松状态处于拧松状态时形成的超螺旋。时形成的超螺旋。拓扑异构酶对DNA的超螺旋进行精确调节,从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类:1、拓扑异构酶:可瞬时打开双螺旋的一条链,然后再连接
20、。不需能量,同转录相关。2、拓扑异构酶;使DNA双链同时断裂,然后再连接。需能量ATP,同复制相关。拓扑异构酶可除去负超螺旋,拓扑异构酶可引入负超螺旋,消除复制前产生的正超螺旋,协同作用控制DNA拓扑结构,有利于DNA解开双螺旋。参与大肠杆菌染色体参与大肠杆菌染色体DNA复制的主要复制的主要PrDNA旋转酶旋转酶引入(或松解)引入(或松解)DNA解链酶解链酶使双螺旋使双螺旋DNA解链解链单链结合蛋白单链结合蛋白稳定单链区稳定单链区引物合成酶引物合成酶合成合成RNA引物引物DNA聚合酶聚合酶III全酶全酶合成合成DNADNA聚合酶聚合酶I除去引物并填满缺口除去引物并填满缺口DNA连接酶连接酶连接
21、连接DNA片段末端片段末端(5)DNA聚合酶的聚合酶的“校对校对”作用作用 DNA聚合酶具有三种不同的酶活性。聚合酶具有三种不同的酶活性。3 5外切酶活性是校对新生外切酶活性是校对新生DNA链和改正链和改正聚合酶活性所造成的聚合酶活性所造成的“错配错配”的一种手段。的一种手段。现在所发现的真核生物现在所发现的真核生物DNA聚合酶一般聚合酶一般没有校正功能。没有校正功能。DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配碱基错配碱基复制方向复制方向正正 确核确核苷酸苷酸555555333333切除错配切除错配核苷酸核苷酸(四)真核细胞(四)真核细胞DNA复制复制 不十分清楚,与原核生物DNA
22、复制比较:(一)一致:(一)一致:1、基本机制相似。如半保留复制、半不连续复制。2、所需酶相似。(二)区别(二)区别 真核生物真核生物 原核生物原核生物复制起始点复制起始点 多个多个 一个一个复制方向复制方向 双向双向 单向单向复制速度复制速度 较快较快 较慢较慢起始点是否连续复制起始点是否连续复制 不不 是是催化催化DNADNA链延长的酶链延长的酶 两种酶(两种酶(polpol、)一种酶(一种酶(polpol)引物酶的结合情况引物酶的结合情况 与与DNADNA聚合酶聚合酶 与解旋酶与解旋酶DNA聚聚合酶合酶定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚基数目4
23、12至少至少21外切酶活性外切酶活性无无无无3 53 53 5引物合成酶引物合成酶活性活性有有无无无无无无无无功能功能复制过程复制过程中合成后中合成后随链随链参与核参与核DNA修复修复线粒体线粒体DNA复制复制催化前导催化前导链合成链合成参与参与DNA修复修复端粒的复制端粒的复制(1)半保留复制)半保留复制(2)可朝一个方向或两个方向进行复制)可朝一个方向或两个方向进行复制(3)DNA两条链都从两条链都从5 3(4)复制是半不连续的,前导链连续,后随链不连)复制是半不连续的,前导链连续,后随链不连续合成续合成(5)合成始于一小段)合成始于一小段RNA引物引物(6)复制有多种机制)复制有多种机制
24、(五)反转录作用(五)反转录作用(RNA指导的指导的DNA合成)合成)指以RNA为模板合成DNA的过程。最先在病毒中发现这种酶,现在发现存在于哺乳动物胚胎和正在分裂的细胞中。条件条件1、反转录酶:是一种多功能酶,具以下特性:(1)以RNA为模板合成DNA;(2)水解RNA,具3 5和5 3外切酶活性;(3)以DNA为模板合成DNA。2、前体物质:dNTP3、引物:短链RNA或DNA 适当浓度的Mg2、Mn24、方向:5 3 过程过程1、以亲代RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链(cDNA),形成RNADNA杂交分子。2、由核糖核酸酶H水解RNADNA杂交分子中的RNA链;3、以刚合成的D
25、NA链为模板合成一条互补的DNA链,形成DNADNA分子;4、DNADNA的去向 (1)整合到宿主细胞DNA分子中,但不表达;(2)DNADNA再转录合成RNA,然后翻译成蛋白质,生成子代RNA病毒。反转录过程中反转录过程中cDNA的合成的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 突变突变 基因组DNA的碱基顺序发生突然而永久性的改变。1 1、点突变:、点突变:指一个或几个碱基对被置换。有两种形式:转换:一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基转换为另一个嘌呤或嘧啶碱基。如TA被CG替换。颠换:嘌呤碱基变成嘧啶碱基或嘧啶碱基变成嘌呤碱基。如T
26、A被AT替换。2 2、结构畸变、结构畸变 DNA的大段碱基发生改变。包括:插入、缺失、倒位、易位。(六)(六)DNA的损伤与修复的损伤与修复 DNA突变突变的类型的类型-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-转换转换野生型基因野生型基因-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(framesshift mutation)-T-C-T-C
27、-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失AT 造造成成DNA损损伤伤的的原原因因可可能能是是生生物物因因素素、物物理理因因素素或或是是化化学学因因素素;可可能能来来自自细细胞胞内内部部,也也可可能能来来自自细细胞胞外外部部;受受到到破破坏坏的的可可能能是是DNA的的碱基、糖基或是磷酸二酯键碱基、糖基或是磷酸二酯键。物理诱变剂:如紫外线、X射线等。生物诱变剂:如噬菌体、抗菌素等。化学诱变剂:直接作用于DNA模板的诱变剂,如亚硝酸、烷化剂等。碱基类似物:如5溴
28、尿嘧啶。移码诱变剂:如普鲁黄。DNA的损伤修复系统的损伤修复系统 1 1、直接修复、直接修复(direct repair)对由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体的光复活作用是一种高度专一的直接修复方式,只作用于由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体。这种结构不能形成碱基配对,使DNA链丧失了模板的功能。用强的可见光照射受损伤的细胞,可见光将光裂合酶激活,此酶与二聚体结合并将其恢复成两个单独的嘧啶碱。胸腺嘧啶的形成示意图DNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于、光复合酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激活4、修复后酶被释放、修复
29、后酶被释放 2 2、切除修复、切除修复(excision repair)是在一系列酶的作用下,将DNA分子中受损伤部分切除掉,并以完整的那一条链为模板,合成出切去的部分,然后使DNA恢复正常结构的过程。包括两个过程:一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位,切除含有损伤结构的核酸链;二是修复合成并连接。DNA的损伤和切除修复的损伤和切除修复碱基丢失碱基丢失碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶AP核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切开切开切除切除修复修复连接连接糖苷酶糖苷酶插入酶插入酶碱基取碱基取代代 细胞含有的DNA糖基化酶能使不正确的碱基或发生改变的碱基的糖苷键断裂,切除碱基,产生一个只保留有脱脱氧氧核核糖糖磷磷酸酸部部分分的位点。称为AP位点(无嘌呤或无嘧啶的位点)。一旦AP位点形成后,即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。在在AP位点必须切除若干核苷酸后才能进行位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成,细胞内没有酶能在修复合成,细胞内没有酶能在AP位点直接将碱位点直接将碱基插入,因为基插入,因为DNA合成的前体物质是核苷酸而合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。不是碱基。
限制150内