实验二溶血空斑meng说课材料.ppt
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1、实验二溶血空斑meng【操作方法操作方法】n n眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp管中,管中,管中,管中,n n4 4 4 4 静置静置静置静置24H24H24H24H 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min,收集血清;,收集血清;,收集血清;,收集血清;n n-20-20-20-20保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正
2、常小鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。小鼠小鼠B B细胞溶血空斑形成试验细胞溶血空斑形成试验n溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体,溶解细胞的原理来检测抗体形成细化补体,溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法,经典的试验是用于胞的一种体外试验方法,经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。检查动物的抗体产生功能。n n将绵羊红细胞(将绵羊红细胞(将绵羊红细胞(将绵羊红细胞(SRBCSRBCSRBCSRBC)免疫过的小鼠脾细胞)免疫过的小鼠脾细胞)免疫过的小鼠脾细胞)免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液,与一定量的绵
3、羊红细胞混合,制成细胞悬液,与一定量的绵羊红细胞混合,制成细胞悬液,与一定量的绵羊红细胞混合,制成细胞悬液,与一定量的绵羊红细胞混合,在补体参与下,使抗体产生细胞周围的在补体参与下,使抗体产生细胞周围的在补体参与下,使抗体产生细胞周围的在补体参与下,使抗体产生细胞周围的SRBCSRBCSRBCSRBC溶解,形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解,形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解,形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解,形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定用于测定用于测定用于测定B B B B细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。【试剂与器材试剂与器材】1.
4、1.健康小鼠(约健康小鼠(约181820 20 克重)。克重)。2.2.绵羊红细胞悬液(绵羊红细胞悬液(2.5%2.5%)。)。3.3.指示细胞悬液:指示细胞悬液:含含10%10%绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液 0.5ml0.5ml,补体(即新鲜豚鼠血清),补体(即新鲜豚鼠血清)0.3ml0.3ml,Hanks Hanks 液液2.0ml2.0ml。4.Hanks 4.Hanks 液(液(pH7.2pH7.2)。)。5.5.动物解剖器械、注射器(动物解剖器械、注射器(5ml5ml)、平皿、中)、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6.6.盖玻片、双面胶、
5、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。【操作方法操作方法】n免疫动物n取2.5%绵羊红细胞悬液2ml,无菌操作注射于小鼠腹腔内。(4 天后追加一次免疫效果更佳)。n n见试验一,已做见试验一,已做制备脾细胞悬液制备脾细胞悬液1.1.将将免免疫疫后后7 7 天天的的小小鼠鼠颈颈椎椎脱脱位位处处死死,75%75%75%75%乙乙乙乙醇醇醇醇浸浸浸浸泡泡泡泡3 3 3 3分钟,取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上;分钟,取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上;分钟,取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上;分钟,取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上;2.2.2.2.在在在在小小小小鼠鼠鼠鼠左左左左腹
6、腹腹腹侧侧侧侧中中中中部部部部剪剪剪剪开开开开小小小小口口口口,撕撕撕撕开开开开皮皮皮皮肤肤肤肤,暴暴暴暴露露露露腹腹腹腹壁壁壁壁,可见红色长条状脾脏;可见红色长条状脾脏;可见红色长条状脾脏;可见红色长条状脾脏;3.3.3.3.在在在在脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下侧侧侧侧提提提提起起起起腹腹腹腹膜膜膜膜,剪剪剪剪开开开开后后后后上上上上翻翻翻翻,暴暴暴暴露露露露脾脾脾脾脏脏脏脏,用用用用镊镊镊镊子子子子提提提提起起起起脾脾脾脾脏脏脏脏,眼眼眼眼科科科科剪剪剪剪分分分分离离离离脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下面面面面的的的的结结结结缔缔缔缔组组组组织织织织,取出脾脏。放入盛有取出脾脏。放入盛有取出脾脏。放入
7、盛有取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 液的培养皿中;液的培养皿中;液的培养皿中;液的培养皿中;4.4.4.4.左左手手持持一一把把小小镊镊子子夹夹住住脾脾脏脏,右右手手用用5ml 5ml 的的注注射射器器抽抽取取平平皿皿内内液液体体(4(4ml)ml)缓缓缓缓注注入入脾脾脏脏内内,将将脾脾细细胞冲洗出来。如此反复冲洗,到脾脏变白为止。胞冲洗出来。如此反复冲洗,到脾脏变白为止。5.5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中,再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中,再用少量用少量Hanks Hanks 液冲洗脾脏及平皿内残留的液冲洗脾脏及平
8、皿内残留的细胞,移入试管内。离心细胞,移入试管内。离心1000 1000 转转/分分5 5 10 10 分分,弃上清,加弃上清,加5ml 5ml 冷红细胞裂解液(冷红细胞裂解液(NHNH4 4Cl Cl 3.735g/450ml 3.735g/450ml 双蒸水双蒸水+Tris 1.3g/50ml+Tris 1.3g/50ml 双蒸双蒸水水pH7.65pH7.65),将细胞离心管插入碎冰中,每),将细胞离心管插入碎冰中,每2 2 分钟摇动分钟摇动1 1 次,裂解次,裂解10 10 分。离心(分。离心(10001000转转/分)分)5 510 10 分。弃上清,用分。弃上清,用Hanks Han
9、ks 液洗液洗2 2 次,离心(次,离心(1000 1000 转转/分)分)5 51010分钟。弃上清。分钟。弃上清。用用用用HanksHanksHanksHanks悬浮细胞,调细胞浓度到悬浮细胞,调细胞浓度到悬浮细胞,调细胞浓度到悬浮细胞,调细胞浓度到2l02l02l02l06 6 6 6/m1/m1/m1/m1。6.6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液吸取此悬液0.1ml 0.1ml 放小试管中,再加放小试管中,再加0.9mlHanks 0.9mlHanks 液,即为液,即为500 500 倍稀释的脾细胞倍稀释的脾细胞悬液。悬液。n n
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