专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段(上课课件)讲课讲稿.ppt
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1、专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段(上课课件).DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成:元素组成:脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位:一一.基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤(腺嘌呤(A A)鸟嘌呤(鸟嘌呤(G G)胞嘧啶(胞嘧啶(C C)胸腺嘧啶(胸腺嘧啶(T T)4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的(即一条的(即一条链为链为3355,另一条链为,另一条链为5533)脱氧)脱氧核苷酸长链盘旋而成的
2、规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。.与与 交替连结,排列在外侧,交替连结,排列在外侧,构成基本骨架;构成基本骨架;排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来,形连结起来,形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对,配对,一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤.DNA.DNA的复制的复制2.2.时期时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。3.3.场所
3、场所细胞核(主要)、线粒体、叶绿体。细胞核(主要)、线粒体、叶绿体。1.1.概念概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。4.4.基本条件基本条件酶酶:解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料:四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链.边解旋边复制边解旋边复制(过程)过程)5.5.复制特点复制特点.半保留复制(结果)半保留复制(结果)6.6.遵循原则:遵循原则:碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因8.8.复制的意义复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传
4、信息从亲代传给了后分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代,从而保持了遗传信息的连续性代,从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结:胞内总结:胞内
5、DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3333端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸(三)(三)PCR(PCR(多聚酶链式反应)多聚酶链式反应)1 1、DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不
6、能从头合成不能从头合成DNADNA,只能从,只能从DNADNA的的33端端开始延伸开始延伸DNADNA链,因此,链,因此,DNADNA复制需要引物复制需要引物.2 2、DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程 当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合母链通过碱基互补配对结合后,后,DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延端开始延伸伸DNADNA链,链,DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸.3 3、PCRPCR原理原理在在8080100C100C的温度范围内,的温度范围内,DNADNA的双螺的双螺旋结构将解体,双链分
7、开,这个过程称为变性旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性当温度缓慢降低后,两条彼此分离的当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链又会重新结合成双链 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理,通过控制温的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合,现在使用的度来控制双链的解聚与结合,现在使用的PCRPCR仪仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题,但是,又导高温解决了打开双链的问题,但是,又导致致DNADNA聚合酶失活的问题,耐高温的聚合酶失活的问题,耐高温的Taq Taq DNADNA聚合酶
8、解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA聚合酶失活聚合酶失活的问题,促成了的问题,促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。4 4、Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质 DNADNA模板,分别与两条模板链相结合的两种模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNADNA聚合酶,聚合酶,同时通过控制温度使同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行。复制在体外反复进行。PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA,而是人工,而是人
9、工合成的合成的DNADNA单链,其长度通常为单链,其长度通常为20203030个脱个脱氧核苷酸氧核苷酸6 6、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶,而是的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的通过对反应温度的控制来实现的7.PCR7.PCR的重要应用:的重要应用:广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。1 1、PCRPCR仪仪.设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的
10、仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管,总容积为,总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体,液体,其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。上的一次性吸液枪头用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液.实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。量离心管里面加入各种试
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