分子生物学基本技术.ppt
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1、质粒的提取质粒的提取(碱法碱法)分子生物学基本技术(一)分子生物学基本技术(一)三峡大学生物化学教研室三峡大学生物化学教研室实验目的w了解碱法提取质粒的原理;了解碱法提取质粒的原理;w掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。一实验背景一实验背景w质粒是染色体外的DNA分子,大小可为1kb到200kb。w大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子,以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。w其复制和遗传独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒特点w质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型,是比病毒更简单的原始生命。w质粒通过细菌的结合作用,从雄性体转移到
2、雌性体,是细菌有性繁殖的性因子.w年由Lederburg正式命名为质粒。结构的三大要素:结构的三大要素:多克隆位点 选择标记(耐药性,LacZ)独立的复制单位种类:种类:质粒 噬菌体 酵母人工染色体(YAC)反转录病毒载体 表达载体等质粒类型w质粒按复制方式分为两种类型:质粒按复制方式分为两种类型:松弛型质粒松弛型质粒 和和 严紧型质粒严紧型质粒w1.松弛型质粒松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白,松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白,完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制,质粒的复制依然进行。质合成受抑制,质粒
3、的复制依然进行。w严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白,质粒的严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白,质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。2.严紧型质粒严紧型质粒质粒的应用w大多数基因工程使用松弛型质粒。w严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。w质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。质粒提取的思路质粒提取的思路w质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量DNADNAw要去除的物质:要去除的物质:蛋白蛋白基因组基
4、因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质RNA RNA 分离质粒DNA方法w从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多,目前常用的w碱变性法;w煮沸法;wSDS法;w 羟基磷灰石层析法等w各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的,其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。碱变性法基本原理w在碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DNA变性,而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。w将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构,大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态,通
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