课题2PCR扩增DNA片段.ppt
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1、课题背景课题背景课题背景课题背景PCRPCRPCRPCR技术是一种体外迅速扩增技术是一种体外迅速扩增技术是一种体外迅速扩增技术是一种体外迅速扩增DNADNADNADNA片段的技片段的技片段的技片段的技术,它能以极少量的术,它能以极少量的术,它能以极少量的术,它能以极少量的DNADNADNADNA为模板,在几小时为模板,在几小时为模板,在几小时为模板,在几小时内复制出上百万份的内复制出上百万份的内复制出上百万份的内复制出上百万份的DNADNADNADNA拷贝。广泛用于遗拷贝。广泛用于遗拷贝。广泛用于遗拷贝。广泛用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基传疾病的
2、诊断、刑侦破案、古生物学、基传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和因克隆和因克隆和因克隆和DNADNADNADNA序列测定。序列测定。序列测定。序列测定。DNADNA多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断课题课题2 21.DNA1.DNA的基本单位的基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸(脱氧核糖核酸)(脱氧核糖核酸)(脱氧核糖核酸)(脱氧核糖核酸)五碳糖五碳糖磷酸基团磷酸基团羟基羟基3 3,端端端端5 5,端端端端ATGCATGC5 5,端(含磷酸基团)端(含磷酸基团)端(含磷酸基团)端(含磷酸基团)3 3,端(含羟基)端(含羟基)端(含羟基)端(含羟基)3 3,端端端端5 5
3、,端端端端2.2.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成3.DNA3.DNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构DNADNA分子是由分子是由 的脱氧核苷酸的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则长链盘旋而成的规则 结构。结构。与与 交替连结,排列在外侧,构交替连结,排列在外侧,构成基本骨架;成基本骨架;排列在链的内侧。排列在链的内侧。两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来,形成碱连结起来,形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与一定与 配对,配对,一定同胞嘧啶一定同胞嘧啶配对。配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行两条反向平行两条反向平行脱氧核糖
4、脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤4.4.复制过程复制过程生物体内生物体内DNADNA分子复制的条件分子复制的条件参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶打开打开DNA双链双链DNA母链母链提供提供DNA复制的模板复制的模板4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成子链的原料合成子链的原料DNA聚合酶聚合酶引物引物使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸催化合成催化合成DNA子链子链3553因此,因此,DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5,端向端向3,端延伸。端延伸。(一)(一)PCR
5、PCR技术的概念技术的概念 是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术,片段的技术,它能以极少量的它能以极少量的DNADNA为模板,在几小时内复为模板,在几小时内复制出上百万份的制出上百万份的DNADNA拷贝。拷贝。(二)(二)PCRPCR技术的应用技术的应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和物学、基因克隆和DNADNA序列测定。序列测定。三、三、基础知识基础知识解旋酶(解旋酶(打开打开DNA双链)双链)DNADNA母链(母链(模板)模板)4 4种脱氧核苷酸(种脱氧核苷酸(合成子链原料)合成子链原料)DNADNA聚合酶(聚合酶(催化子
6、链合成)催化子链合成)引物引物(RNA)()(使使DNA聚合酶能聚合酶能从引物从引物3端开始连接脱氧核苷酸)端开始连接脱氧核苷酸)自主阅读自主阅读P59,并,并思考:思考:体外扩增体外扩增DNADNA,需要怎样环境?,需要怎样环境?变性变性(80-100)TaqTaq聚合酶(耐高温)聚合酶(耐高温)20203030个核苷酸构个核苷酸构成成DNADNADNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸缓冲溶液,控制温度缓冲溶液,控制温度PCRPCR技术总结技术总结 利用利用DNA分子的热变性原理,通过控制分子的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解旋与结合,从而完成体外温度来控制双链的解旋与结合
7、,从而完成体外DNA分子的扩增。分子的扩增。四种脱氧核苷酸、耐热四种脱氧核苷酸、耐热的的DNADNA聚合酶、引聚合酶、引物、物、DNADNA模板模板、缓冲溶液和控制温度的温控缓冲溶液和控制温度的温控设备。设备。子链的子链的5端向端向 3端延伸端延伸 具有特异、敏感、产率高、快速、具有特异、敏感、产率高、快速、简便、简便、重复性好、易自动化等突出。重复性好、易自动化等突出。5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/(四)(四)PCRPCR的反应过程的反应过程5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5
8、 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 经经n次循环(复制)后,次循环(复制)后,DNA的含量理论的含量理论上可以扩大到上可以扩大到 倍。倍。2n每次循环分为:每次循环分为:PCRPCR的反应过程总结的反应过程总结变性变性 复性复性延伸延伸 DNADNA聚合酶只能特异性地聚合酶只能特异性地复制处于两个引复制处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列序列,使这段,使这段固定固定长度的序列呈长度的序列呈指数指数扩增。扩增。从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物为模板参与反应,并且由引物延伸而成的延伸而成的D
9、NADNA单链会与引物单链会与引物结合,进行结合,进行DNADNA的延伸的延伸PCR的反应结果的反应结果模拟PCR扩增DNA 二、二、PCR反应的实验操作反应的实验操作1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR仪仪仪仪(一)设备及用具(一)设备及用具2 2 2 2、微量离心管、微量离心管、微量离心管、微量离心管一种薄壁塑料管,总容积为一种薄壁塑料管,总容积为一种薄壁塑料管,总容积为一种薄壁塑料管,总容积为0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml3 3 3 3、微量移液器、微量移液器、微量移液器、微量移液器用于定量转移用于定量转移用于定量转移用于定量转移PCRPCRPCRPCR配方中的液体,其上的
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