real-time PCR.pptx
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1、荧光实时荧光实时定量定量PCRReal-timePCR报告人:余祥单报告人:余祥单目录目录A.A.定义定义B.B.B.B.化学原理化学原理化学原理化学原理C.C.C.C.数学数学数学数学原理原理原理原理D.D.荧光定量荧光定量PCR如何减小如何减小误差误差E.E.E.E.引物设计要求引物设计要求引物设计要求引物设计要求F.F.F.F.实验流程实验流程实验流程实验流程G.G.G.G.基因拷贝数计算基因拷贝数计算基因拷贝数计算基因拷贝数计算过程过程过程过程H.H.H.H.定量定量定量定量PCRPCR仪主机的维护仪主机的维护仪主机的维护仪主机的维护 I.I.I.I.问题及解决办法问题及解决办法问题及
2、解决办法问题及解决办法A.定义定义实时突光定量PCR(Real-timePCR):在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控,以此实现对初始模板的定量分析。B.如何知道基因数目的增加?如何知道基因数目的增加?荧光信号与基因拷贝数成正比TaqMan探针法探针法每扩增一条每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan探针探针优缺点优缺点优点:优点:1、对对目标序列的高特异性目标序列的高特异性2、设计设计相对简单相对简单3、重复性重复性比较好比较好缺点:缺点:1、只只适合一个特
3、定的适合一个特定的目标目标2、需、需委托委托公司标记,价格公司标记,价格较高较高3、不易不易找到本底低的探针找到本底低的探针SYBRGreenSYBRGreen能结合到双链能结合到双链DNA的小沟的小沟部位部位只有只有和双链和双链DNA结合后才结合后才发发出出荧光荧光DNA双链双链分开分开就不发出就不发出荧光荧光SYBRGreen优点优点及及缺点缺点优点优点:1、对对DNA模板没有模板没有选择性选择性,适用于任何适用于任何DNA2、使用方便使用方便,不必不必设计复杂设计复杂探针探针3、非常灵敏非常灵敏;便宜便宜。缺点缺点:1、对、对 PCR有有一定的一定的抑制作用抑制作用2、容易容易与非特异性
4、双链与非特异性双链DNA结合,结合,产产生生假假阳性阳性(可通过溶解曲线判断非特异性扩增)溶解曲线C.定量定量原理原理:理想的PCR反应:X=X0*2n非理想的PCR反应:X=X0(1+E)nn:扩增反应的循环次数X:第n次循环后的产物量X0:初始模板量E:扩增效率取对数:logX=n(1+E)+logX0logX=n(1+E)+logX0标准曲线标准曲线绝对绝对定量定量D.荧光定量荧光定量PCR如何减小误差如何减小误差1、校准生物学误差:内参(管家基因)2、校准物理误差:参比荧光 3、降低随机误差 1、校准、校准生物学误差内参生物学误差内参(管家基因管家基因)内参基因(EndogenousC
5、ontrol)用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因:核酸提取时通常以重量,体积或细胞数为单位取 样,提取过程中存在得率差异和操作误差,造成等量样品不一定获得等量提取物 目的:将定量结果校准为以基因组(或单个细胞)为 单位,不同样品之间才具有可比性 校准方法:目的基因/内参=均一化的目的基因表达量 MasterMix中中ROX浓度固定浓度固定 ROX不参与不参与PCR扩增,信号强度只与扩增,信号强度只与MasterMix用量有关用量有关 ROX的功能:校准物理误差的功能:校准物理误差 耗材质量、管盖厚度、透光性能耗材质量、管盖厚度、透光性能 反应体系监控:蒸发、操作反应体系监控:蒸发
6、、操作 2、校准、校准物理误差:参比物理误差:参比荧光荧光3、降低、降低随机误差随机误差:重复实验重复实验 生物学重复:样品三次重复 技术重复:每个样品做3-4个复孔 E.引物引物设计的要求:设计的要求:Tm=55-65GC=30-80%PCR扩增产物长度:在80-150bp之间 引物的退火温度要高,一般要在 60以上,15-25个碱基特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在F.整体实验过程整体实验过程1.扩增标准菌的目的片段2.连接到质粒上,转化进大肠杆菌中扩大培养3.提取质粒,计算拷贝数4.将质粒稀释至少5个梯度,作为标准品绘制标准曲线5.扩增待测样品基因片段6.标准品和待测样品一起qP
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