第4章 电泳技术.ppt
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1、医用检验技术及应用 电泳技术电泳技术电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术目目 录录第一第一节区区带电泳泳 第二第二节等等电聚焦聚焦电泳泳 第三第三节SDS-PAGE电泳泳 第四第四节二二维电泳泳 第五第五节印迹技印迹技术 第六第六节免疫免疫电泳泳 第七第七节高效毛高效毛细管管电泳技泳技术 第八第八节电泳分析泳分析仪 医用检验技术及应用 电泳技术基本原理基本原理不同性不同性质的的质点,由于点,由于带电性性质及及电量不同,在量不同,在一定一定电场强度下移度下移动的方向和速度亦不同。的方向和速度亦不同。蛋白蛋白质质分子分子为为两性两性电电解解质质等等电点点pH等等电点点 带负电pH等等电点点 带正正
2、电医用检验技术及应用 电泳技术质点所带净电荷量越多(介质的质点所带净电荷量越多(介质的pH值离等电点越远)值离等电点越远)质点的直径越小质点的直径越小越接近球形越接近球形则它在电场中的泳动速度越快,迁移率亦越大。则它在电场中的泳动速度越快,迁移率亦越大。基本原理基本原理医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用血清蛋白用血清蛋白电泳泳图图 6-1 6-1 正常血清蛋白电泳图谱正常血清蛋白电泳图谱上图:箭头示电泳方向,右侧示各条带的主要组分;上图:箭头示电泳方向,右侧示各条带的主要组分;下图:光密度扫描后电泳图谱;下图:光密度扫描后电泳图谱;HPHP:触珠蛋白;:触珠蛋
3、白;CPCP:铜蓝蛋白:铜蓝蛋白Alb:清蛋白:清蛋白1:1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶2:HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白:运铁蛋白、补体系统、:运铁蛋白、补体系统、脂蛋白:IgG、IgM、IgA、IgD、IgE医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳 图图6-2 6-2 几种常见异常血清蛋白图谱几种常见异常血清蛋白图谱A A:双清蛋白血清电泳图;:双清蛋白血清电泳图;B B:慢性肝病或肝硬变常见的:慢性肝病或肝硬变常见的-融融合的桥连现象;合的桥连现象;C C:免疫球蛋白寡克隆增生型;:免疫球蛋白寡克隆增生型;D D:M M蛋白血清蛋白血清型(型(IgAIgA型);型);N N:正常对照血清
4、;:正常对照血清;P P:患者血清:患者血清A BC D医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用用 同工同工酶电泳泳 图图6-3 LDH6-3 LDH同工酶区带电泳图谱同工酶区带电泳图谱左:左:5 5份血清份血清iso-LDHiso-LDH电泳图;右:电泳图;右:iso-LDHiso-LDH电泳示意图电泳示意图医用检验技术及应用 电泳技术第一节第一节 区带电泳区带电泳检验医学中的医学中的应用用 同工同工酶电泳泳 图图6-4 CK6-4 CK同工酶示意图同工酶示意图左:血清左:血清iso-CKiso-CK电泳图,电泳图,3 3示正示正常血清(常血清(CK MB5%CK
5、 MB5%CK MB5%););4 4示示CK BBCK BB阳性;阳性;右:右:iso-CKiso-CK电泳图谱示意图电泳图谱示意图 医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳实验原理原理 让pHpI(max)所有所有蛋白蛋白质带负电各种蛋白各种蛋白质带电量不同量不同电泳速度不同泳速度不同经过一段一段时间电泳后,各种蛋白泳后,各种蛋白质被区分开被区分开医用检验技术及应用 电泳技术区带电泳区带电泳图图 6-1 6-1 正常血清蛋白电泳图谱正常血清蛋白电泳图谱上图:箭头示电泳方向,右侧示各条带的主要组分;上图:箭头示电泳方向,右侧示各条带的主要组分;下图:光密度扫描后电泳图谱;下图:光密度扫描
6、后电泳图谱;HPHP:触珠蛋白;:触珠蛋白;CPCP:铜蓝蛋白:铜蓝蛋白Alb:清蛋白:清蛋白1:1酸性糖蛋白、1抗胰蛋白酶2:HP、CP、2巨球蛋白、脂蛋白:运铁蛋白、补体系统、:运铁蛋白、补体系统、脂蛋白:IgG、IgM、IgA、IgD、IgE医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳检验医学中的医学中的应用用次次级同工同工酶的分离的分离 图图 6-5 6-5 碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱左:左:iso-ALPiso-ALP等电聚焦示意图;右:胆道梗阻性疾病等电聚焦示意图;右
7、:胆道梗阻性疾病iso-ALPiso-ALP电泳图谱电泳图谱医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 区区带电泳的原理是不同的蛋白泳的原理是不同的蛋白质有不同的有不同的电泳速度泳速度那么可不可以有另外一种方法:使得不同蛋白那么可不可以有另外一种方法:使得不同蛋白质在在泳道中本来就有泳道中本来就有“固定固定”位置,蛋白位置,蛋白质在相在相应的位的位置上停留?置上停留?蛋白蛋白质如何能如何能够停止停止电泳?泳?除了切断除了切断电源之外?源之外?蛋白蛋白质不不带电了了蛋白蛋白质处于等于等电点溶液中点溶液中医用检验技术及应用 电泳技术第二节第二节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 基
8、本原理基本原理在等在等电聚焦聚焦电泳泳时必必须有一个有一个稳定的定的pH梯度介梯度介质,使,使pH值从正极向从正极向负极极渐次增加,形成一次增加,形成一线性性pH梯度梯度。蛋白蛋白质混合物加入有混合物加入有pH梯度的梯度的电泳管中,在泳管中,在电场中中经一定一定时间后,混合物中各后,混合物中各组分将分分将分别聚焦聚焦在在与各与各等等电点点相相应的的pH介介质区域,形成分离的各种区域,形成分离的各种蛋白蛋白质区区带。这就是就是等等电聚焦聚焦电泳泳分离蛋白分离蛋白质的基的基本原理。本原理。医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳 等等电聚焦根据等聚焦根据等电点将蛋白点将蛋
9、白质分离分离那那还能不能根据其他性能不能根据其他性质将蛋白将蛋白质分离分离?区区带电泳的泳的电泳速度的影响条件泳速度的影响条件较多多(大小、(大小、电荷、形状),不是根据荷、形状),不是根据单一一性性质分离分离有一种方法能根据蛋白有一种方法能根据蛋白质的分子量使之的分子量使之带上相上相应的的电荷,荷,远远大于蛋白大于蛋白质本身本身电荷的大小,并使荷的大小,并使电荷成荷成为电泳速度的泳速度的主要决定因素,那么主要决定因素,那么电泳速度只和分子泳速度只和分子量相关量相关医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳 SDS是一种阴离子表面活性是一种阴离子表面活性剂,能使能使蛋白
10、蛋白质负载了大量了大量负电荷,大大超荷,大大超过了天然了天然蛋白蛋白质的原有的原有电荷,因此蛋白荷,因此蛋白质之之间原原有有电荷的差异就无荷的差异就无显著效著效应,蛋白,蛋白质带电量量的多少,只与蛋白的多少,只与蛋白质大小即大小即分子量分子量有关,有关,此此时,不同泳不同泳动速率速率仅反映了各反映了各蛋白蛋白质亚基的分子量的差基的分子量的差别。医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳检验医学中的医学中的应用用非非浓缩尿蛋白尿蛋白电泳泳图图 6-7 6-7 非浓缩尿蛋白电泳非浓缩尿蛋白电泳示意图示意图医用检验技术及应用 电泳技术第三节第三节 SDS-PAGE电泳电泳检验
11、医学中的医学中的应用用非非浓缩尿蛋白尿蛋白电泳泳 图图 6-8 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱临床常见蛋白尿电泳图谱左:肾小球性蛋白尿;左:肾小球性蛋白尿;中:肾小管性蛋白尿,泳道中:肾小管性蛋白尿,泳道4 4示混合性蛋白尿,肾小管性蛋白尿为主型;示混合性蛋白尿,肾小管性蛋白尿为主型;右:混合型蛋白尿右:混合型蛋白尿医用检验技术及应用 电泳技术一个条带中仍是混合着多种蛋一个条带中仍是混合着多种蛋白质,如何再把它们分开呢?白质,如何再把它们分开呢?医用检验技术及应用 电泳技术第四节第四节 二维电泳二维电泳图图 6-9 6-9 二维电泳原理及流程图二维电泳原理及流程图医用检验技术及应用 电泳技术第
12、四节第四节 二维电泳二维电泳 基本原理基本原理第一第一维电泳泳,即等,即等电聚焦聚焦电泳泳(isoelectric focusing,IEF)其基本原理是利用蛋白其基本原理是利用蛋白质分分子等子等电点的不同点的不同对其其进行分离;行分离;第二第二维电泳泳,即,即SDS-聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(SDS-PAGE),使,使电泳迁移率主要取决于蛋泳迁移率主要取决于蛋白白质或或亚基分子量的大小。基分子量的大小。医用检验技术及应用 电泳技术第四节第四节 二维电泳二维电泳检验医学中的医学中的应用用医用检验技术及应用 电泳技术一个问题:如何确定某个条带一个问题:如何确定某个条带是什么蛋白质?是什么
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