酶的活性.ppt
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1、生生物物化化学学第二章第二章 核酸的化学核酸的化学核酸的性质与核酸的性质与 研究方法研究方法4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 5 5 核酸的分离纯化、测定核酸的分离纯化、测定 及研究方法及研究方法第二章第二章 核酸的化学核酸的化学 核酸的性质是由其结构决定的。核酸的性质是由其结构决定的。核酸核酸的结构特点的结构特点是分子大是分子大,有一些可解离的基有一些可解离的基团团,具有共轭双键等具有共轭双键等.这些特点决定了核酸这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础及其组分核苷酸性质的基础.下面介绍几下面介绍几种重要的性质种重要的性质:2.6 2.6 核酸的理化性质核酸的理化性质一、物理性质一、物
2、理性质1 1、性状性状:RNARNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉末或结晶;末或结晶;DNADNA则为疏松石棉一样的纤维状固体。则为疏松石棉一样的纤维状固体。2 2、粘性粘性:核酸的水溶液粘度很大,核酸的水溶液粘度很大,粘度粘度DNADNA大于大于RNARNA。核酸变性后,粘度下降。核酸变性后,粘度下降。2.6 2.6 核酸的理化性质核酸的理化性质3 3、溶解性溶解性:RNARNA和和DNADNA都是都是极性的化合物极性的化合物,一般说来,这些化,一般说来,这些化合物都合物都微溶于水微溶于水,不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机
3、溶剂不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们。它们的的钠盐钠盐易溶于水。易溶于水。DNADNA和和RNARNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。蛋白。DNADNA核蛋白与核蛋白与RNARNA核蛋白的溶解度受溶液的核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度盐浓度的影响的影响而不同。而不同。DNADNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加;蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加;而而RNARNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小.4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质二、核酸的紫外吸收性质:二、核酸的紫外吸收性质:核酸分子中含有
4、嘌呤碱和嘧啶碱,因而具有紫外吸收的性质,在核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱,因而具有紫外吸收的性质,在260260nmnm处核酸紫外吸收最强。核酸紫外吸收是核酸定量测定的基础。处核酸紫外吸收最强。核酸紫外吸收是核酸定量测定的基础。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA(或(或RNA)20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用的应用三、核酸结构的稳定性三、
5、核酸结构的稳定性 核酸的结构相当稳定核酸的结构相当稳定,其主要原因有其主要原因有:1 1、碱基对间的氢键、碱基对间的氢键 在在DNADNA双螺旋和双螺旋和RNARNA的双螺旋区,碱基对的大小使的双螺旋区,碱基对的大小使其在螺旋内的距离很适合于形成氢键其在螺旋内的距离很适合于形成氢键、碱基堆积、碱基堆积碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用、环境中的正离子、环境中的正离子4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质四、核酸的两性电离与等电点四、核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性,碱基具有碱性,因此,核酸的磷酸基具有酸性,碱基具有碱性,因此,核酸具有核酸
6、具有两性电离的性质两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性,其等电点偏酸性。性大于碱基的碱性,其等电点偏酸性。DNADNA的的pIpI约约为为4 45 5,RNARNA的的pIpI约为约为2.02.02.52.5,在在pH7pH78 8电泳时电泳时泳向正极。泳向正极。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质五、五、DNADNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交 DNADNA双螺旋结构模型,不仅与其生物功能有密切关系,还双螺旋结构模型,不仅与其生物功能有密切关系,还能解释能解释DNADNA的重要特性变性与复性,这对于深入了解的重要特性变性与复性,这对于深入了解
7、DNADNA分子分子结构与功能的关系又有重要意义。结构与功能的关系又有重要意义。(一)(一)DNADNA变性变性(denaturationdenaturation)1 1、DNADNA变性的概念变性的概念:指:指DNADNA分子中的双螺旋结构解链为无规分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。则线性结构的现象。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质2 2、DNADNA变性的本质变性的本质:维持双螺旋稳定性的:维持双螺旋稳定性的氢键断裂氢键断裂,碱基间碱基间的堆积力的堆积力遭到破坏,但不涉及到其一级结构的改变。遭到破坏,但不涉及到其一级结构的改变。3 3、导致导致DNADNA变性的因素变性的因
8、素:凡能破坏双螺旋稳定性的因素,如凡能破坏双螺旋稳定性的因素,如加热、极端的加热、极端的pHpH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可引起核酸分子变性。均可引起核酸分子变性。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4、变性变性DNADNA的特征:的特征:(1 1)溶液粘度降低:)溶液粘度降低:DNADNA双螺旋是紧密的刚性结构,变性双螺旋是紧密的刚性结构,变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构,因此粘度明后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构,因此粘度明显下降。显下降。(2 2)
9、旋光性发生变化:变性后整个)旋光性发生变化:变性后整个DNADNA分子的对称性及分分子的对称性及分子构型改变,使子构型改变,使DNADNA溶液的旋光性发生变化。溶液的旋光性发生变化。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 (3 3)紫外吸收增强)紫外吸收增强 增色效应增色效应(hyperchromichyperchromic effect)effect):指指DNADNA变性后其紫外吸收变性后其紫外吸收明显增强的效应。明显增强的效应。DNADNA分子中碱基间电子的相互作用使分子中碱基间电子的相互作用使DNADNA分子分子具有吸收具有吸收260260nmnm波长紫外光的特性。在波长紫外光的特性。在
10、DNADNA双螺旋结构中碱基藏双螺旋结构中碱基藏入内侧,变性时入内侧,变性时DNADNA双螺旋解开,于是碱基外露,碱基中电子双螺旋解开,于是碱基外露,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 可见,可见,DNADNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中,紫外光吸收值达到最大值的常将核酸加热变性过程中,紫外光吸收值达到最大值的50%50%时的温度称为核酸的解链温度,由于这一现象和结晶的融解时的温度称为核酸的解链温度,由于这一现象和结晶的融
11、解相类似,又称相类似,又称融解温度融解温度(Tm,melting temperature)Tm,melting temperature)。在在TmTm时,时,核酸分子内核酸分子内50%50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的TmTm值值与其与其G GC C所占总碱基数的百分比成正相关,两者的关系可表所占总碱基数的百分比成正相关,两者的关系可表示为:示为:4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质Tm=69.3Tm=69.30.41(G+C)%0.41(G+C)%一定条件下一定条件下(相对较短的核酸分子相对较短的核酸分子),TmTm
12、值大小值大小还与还与核酸分子的长度核酸分子的长度有关,核酸分子越长,有关,核酸分子越长,TmTm值值越大;另外,越大;另外,溶液的离子强度溶液的离子强度较低时,较低时,TmTm值较低,值较低,融点范围也较宽,反之亦然,因此融点范围也较宽,反之亦然,因此DNADNA制剂不应保制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。存在离子强度过低的溶液中。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质(二二)DNADNA的热变性与复性的热变性与复性(renaturationrenaturation)指经加热变性的指经加热变性的DNADNA在适当条件下,二条互补链全部在适当条件下,二条互补链
13、全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性逆转过程。热变性DNADNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为程称之为退火退火(annealing)annealing)。这一术语也用以描述杂交核这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成酸分子的形成(见后见后)。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 DNADNA的复性不仅受温度影响,还受的复性不仅受温度影响,还受DNADNA自身特性等其自身特性等其它因素的影响:它因素的影响:1
14、1、温度和时间:、温度和时间:一般认为比一般认为比Tm Tm 低低2525左右的温度是复性的最佳条件,左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。复性时温度下降必须是越远离此温度,复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过一缓慢过程,若在超过TmTm的温度下迅速冷却至低温的温度下迅速冷却至低温(如如44以下以下),复性几乎是不可能的,核酸实验中经常以此方式,复性几乎是不可能的,核酸实验中经常以此方式保持保持DNADNA的变性的变性(单链单链)状态。这说明降温时间太短以及温状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。差大均不利于复性。4 4 核酸的理化性质核酸的理
15、化性质2 2、DNADNA浓度:浓度:溶液中溶液中DNADNA分子越多,相互碰撞结合的机会越大,有利分子越多,相互碰撞结合的机会越大,有利于复性。于复性。3、DNA顺序的复杂性:顺序的复杂性:简单顺序的简单顺序的DNADNA分子,如多聚分子,如多聚(A)A)和多聚和多聚(U)U)这二种单链这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序序列复性时,互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补,则困难得多。列要实现互补,则困难得多。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 DNADNA的变性和复性原理,现已在的变性和复性原理,现已在医学医学和和生命科生命科学学上得到广泛的应用。如核
16、酸杂交与探针技术,上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术,聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain polymerase chain reaction,PCR)reaction,PCR)技术等。技术等。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质(三)分子杂交:(三)分子杂交:(hybridization)hybridization)不同来源的核酸变性后,合并在一处进行复性,这不同来源的核酸变性后,合并在一处进行复性,这时,只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱时,只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段,复性也会发生于不同来源的核酸基互补配对的片段,复性也会发
17、生于不同来源的核酸链之间,即形成所谓的链之间,即形成所谓的杂化双链杂化双链(heterodupheterodup lexlex),这个过程称为这个过程称为杂交杂交(hybridization)hybridization)。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 杂交可以发生于杂交可以发生于DNADNA与与DNADNA之间,也可以发生于之间,也可以发生于RNARNA与与RNARNA之间和之间和DNADNA与与RNARNA之间。之间。例如,一段天然的例如,一段天然的DNADNA和这段和这段DNADNA的缺失突变体的缺失突变体(假定这种突变是假定这种突变是DNADN
18、A分子中部丢失了若干碱基对分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交,电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓一起杂交,电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度,可确定缺失突变发起小泡。测定小泡位置和长度,可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。生的部位和缺失的多少。4 4 核酸的理化性质核酸的理化性质 核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一,不仅可用来检验核酸的缺失、常用手段之一,不仅可用来检验核酸的缺失、插入,还可用来考察不同生物种类在核酸分子插入,还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中中的共同序列和不同
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