NY∕T 3152.6-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第6部分:藻类生长影响试验(农业).pdf
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1、ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.6一2017微生物农药环境风险评价试验准则第6部分:藻类生长影晌试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide一Part 6:AIgae growth effect test 2017-12-22发布2018-06-01实施、-中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.6-2017 前言NY/T 3152(微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分一一第1部分:鸟类毒性试验;一一第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分
2、:鱼类毒性试验;二一第5部分:渣类毒性试验;一一第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T315 2的第6部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业司提出并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:周欣欣、卡元卿、周军英、曲甏甏、姜锦林、杨鸿波、续卫利。I 1 范围微生物农药环境凤险评价试验准则第6部分:藻类生长影晌试验NY/T 3152.6-2017 本部分规定了微生本要求。、质量控制、试验报告等的基本部分适用3.3 3.4 细菌芽泡
3、、真菌抱子、protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽抱完整的实体。3.5 细菌营养体的单位unit of vegetative bacteriwn、虫、草、鼠等的培养基上形成单个CFU的一个单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生动物protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、抱子或抱囊。3.7 病毒virus 1 NY/T 3152.6-2017 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。3.8 最大危害暴露量maximum hazard 呵。surelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量,通常以预测暴
4、露量与安全系数的乘积来表示。3.9 半效应浓度mian effective concentration,EC;o 生长影响试验中,在规定时间内,使受试藻类生长量或生长率较空白对照组的差异为50%时的供试物浓度,用ECso表示。本部分中,以藻类生长量变化百分率计算而得到的半效应浓度用EyCso表示;以藻类生长率变化百分率计算而得到的半效应浓度用ErCso表示。3.10 平均生长率average growth rate 一定暴露时间内藻类单位生物量增长的对数值,在本部分中用表示。3.11 生物量增长yield 一段暴露时间内藻类单位生物量的增加量,即暴露结束时的单位生物量减去暴露开始时的单位生物量
5、,在本部分中用Y表示。4 试验概述在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试藻类生长的影响。当供试物最大危害暴露量处理组中较对照组藻类生长影响达到50%及以上时,则还需进行供试物对藻类剂量效应试验,以测定ECso值及其95%置信限。5 试验方法5.1 材料和条件5.1.1 试验生物受试藻可来自绿藻门、裸藻门、轮藻门和蓝藻门等,推荐普通小球藻(Chlorellavulgaris)、斜生栅列藻(Scenedesmusobliquus)或羊角月芽藻(Selenastrumca pricornutum)等。5.1.2 供试物5.1.2.1 类型微生物母药、制剂产品等。5.1.2.2 批次通常
6、情况下,试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时,应在试验报告中记录供试物的批次。5.1.2.3 计数方法2 计数方法如下:一一细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定;真菌抱子以CFU为计数单位,可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定;一一原生动物以个体数目为计数单位,可采用血球计数板法等测定;一一病毒以包涵体等感染单位为计数单位,可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定;一一其他单位,根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。以上推荐计数方法,参见附录A、附录B、附录C.5.1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。分光光度计。聚合酶链
7、式反应仪。水质测定仪。温湿度计。玻璃器皿。天平等。NY!T 3152.6-2017,光照强度差异虑供试物照供试微生物农药推荐施最大危害暴露量。当因制剂剂型、水质等原因,不能达到最大危害妻111s.,.院能达到的最大量进行试验。试验开始后,每日记录藻类生长情况。当受试藻在试验期间未出现生长受影响情况,则无需进行剂量效应试验;当受试藻在试验期间生长影响达到50%及以上时,则需进行剂量效应试验。5.2.6 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度,试验观察期为96h,每隔24h取样,在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数,计算各处理浓度下藻类生长变化率,并据此
8、计算半效应浓度ECs。值及其95%置信限。5.3 数据处理5.3.1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3、5.3.4、5.3.5中所述的统计学方法,也可根据试验情况NY/T 3152.6一2017选择其他合适的统计方法。5.3.2 差异显著性检验5.3.2.1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析COne-WayANOVA,LSD检验)等。显著水平取户0.05(差异显著)、0.01(差异极显著)。5.3.2.2 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。式中:主1)(2一-分别为两样本平均数;41,42一-分别为
9、两样本方差;n 一一样本容量。(1)5.3.2.3 One-Way ANOVA方差分析(LSD检验)3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(2)计算。LSD.=t.(df,)乌寸2(2)式中:t.叫一一在F检验中误差自由度下,显著水平为的临界t值;马为一一均数差异标准误,按式(3)计算。SHJ=d丽./石.(3)式中:MS,-F检验中误差均方;n 一一各处理重复数。5.3.3 生物量增长的影晌百分率处理组藻类生物量的影响百分率按式(4)计算。L=Y,-Y,y一飞X100.(式中:Iy 处理组生物量变化百分率,单位为百分率(%);Y,一一空白对照组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时
10、单位为个每毫升(个/mL);Y,一-处理组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。5.3.4 生长率的影晌百分率4 处理组藻类生长率的影响百分率按式(5)计算。式中:I,=二二丘,X 100.(5)z 1,一一处理组藻类生长率变化百分率,单位为百分率(%);件一一空白对照组生长率的平均值;问一一处理组生长率的平均值。其中,按式(6)计算。lnX-lnX 户=一一一一=X 100 (6)tj-ti NY/T 3152.6-2017 式中:j-j一二在时间点z到时间点j之间的平均生长率,单位为百分率c%);Xj一一在时间点1时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(
11、个/mL);X;-一在时间点Z时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mU;tj,tj一一试验开始z点和观察J点的时间,单位为小时(灿,tj一般为O.5.3.5 半数效应浓度按藻类生物量变化百分率和藻类生长率变化百分率分别计算半数效应浓度EyCso和ErCso.采用合适的统计学软件分析藻类数据,计算且画监.2.4人48人72人9 6旧的半效应浓度及其95%置信限。具体计算方法见5.4 质量控制6 一一受试生一一对照组月牙藻应控制在2.OX 10个/组成信5 NY/T 3152.6-2017 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法1)A.1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后,在固
12、体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落,因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量。A.2 试剂蛋白陈。牛肉膏。氯化锅CNaCI)。氢氧化纳溶液:1mol/L。盐酸溶液:1 mol/L.葡萄糖。磷酸二氢例CKH2PO,)。硫酸缓CMgSO,)。琼脂。孟加拉红。蒸馆水。氯霉素。A.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台。酸度计等。A.4 固体培养基平板的制备A.4.1 细菌培养基平板依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化纳5g、琼脂15g18g,溶于900mL蒸馆水中,置于电炉上加热,搅拌至完全溶解,加蒸馆水至1000mL。以1mol/L氢氧化纳溶液或1mol/L盐酸溶液
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