微生物学实验室常用试剂与培养基教学资料.doc
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1、Good is good, but better carries it.精益求精,善益求善。微生物学实验室常用试剂与培养基-微生物学实验室常用试剂与培养基-第一节常用试剂及其使用方法一、诊断用纸片杆菌肽纸片(0.04U/片):抑菌圈10mm为敏感。质控菌株:D群链球菌阴性,A群链球菌阳性。SMZ纸片(1.25g/片、23.75g/片):出现抑菌圈即为敏感。质控菌株:D群链球菌阳性,A群链球菌阴性。新生霉素纸片(5.0g/片):抑菌圈16mm为敏感。质控菌株:表皮葡萄球菌阳性,腐生葡萄球菌阴性。O129纸片、奥普托欣(Optochin)纸片:参见第五节生化试验培养基。二、诊断用血清1.沙门菌属诊
2、断血清A-F群O多价诊断血清。特异O群因子诊断血清:常用的有O2,O4,O7,O9,O10诊断血清。特异H因子诊断血清常用的有Ha,Hb,Hc,Hd,Hgm,Hi,Hf、Vi因子诊断血清。2.志贺菌属诊断血清志贺菌属4种多价血清:痢疾志贺菌、血清,福氏志贺菌多价血清及分型血清(16型),宋内志贺菌诊断血清,鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。3.致病性大肠埃希菌诊断血清肠致病性大肠埃希菌(EPEC)诊断血清,产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)诊断血清,肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)诊断血清,肠出血性大肠埃希菌(EHEC)诊断血清O157:H7。4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛
3、O139分型血清5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清6.链球菌分类诊断血清7.肺炎链球菌诊断血清8.耶尔森菌诊断血清三、常用染色液1.革兰染色液结晶紫溶液A液:结晶紫20g,95%乙醇20ml;B液:草酸铵0.8g,蒸馏水80ml。染色前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。脱色液:95%乙醇复染液:沙黄2.5g,95%乙醇100ml为贮存液,取贮
4、存液10ml,加蒸馏水90ml为应用液。2.抗酸染色液碱性复红染色液:萋纳石炭酸复红溶液:碱性复红乙醇饱和溶液10ml,5%石炭酸溶液90ml。脱色液:浓盐酸3ml,95%乙醇97ml。复染液(吕弗勒美蓝液):美蓝乙醇饱和溶液30ml,100g/L氢氧化钾溶液0.1ml,蒸馏水100ml。金胺O-罗丹明B染色液:罗丹明B液:罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。1g/L金胺O液:金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸5ml,混匀。3%盐酸乙醇。稀释美蓝液:吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。3.鞭毛染色液(改良Ryu法)A液:5%石炭酸10ml,鞣酸2g,饱和硫酸铝钾溶液1
5、0ml;B液:结晶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。4.异染颗粒染色液甲液:甲苯胺蓝0.15g,孔雀绿2g/L,95%乙醇2.0ml,蒸馏水100ml。乙液:碘2g,碘化钾3g,蒸馏水300ml。先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后,加蒸馏水至300ml。5.荚膜染色液印度墨汁或50g/L黑色素水溶液第二节 5g/L苯胺蓝水溶液。第三节 基础培养基一、液体基础培养基1.蛋白胨水用途用于细菌靛基质试验;一般细菌培养和传代。配法蛋白胨(或胰蛋白胨)10g,氯化钠5g,蒸馏水1L。将上述成分溶于水中,校正pH至7.2,分装试管
6、,每管23ml,置121灭菌15min备用。质量控制大肠埃希菌生长良好,靛基质阳性;伤寒沙门菌生长良好,靛基质阴性。2.营养肉汤用途一般细菌的增菌培养,加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。配法蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,蒸馏水1L。将上述成分称量混合溶解于水中,校正pH至7.4,按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121灭菌15min,作无菌试验后冷藏备用。质量控制金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌生长良好。保存置冰箱3周内用完。3.牛肉浸液培养基用途细菌培养最基础的培养基,除用于一般细菌的培养外,又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。配法新鲜除脂牛肉500g,氯化钠5g蛋白胨10g,蒸
7、馏水1L。先将牛肉清洗,除脂肪、肌腱,并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L,搅匀后置冰箱过夜,次日煮沸加热30min,并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤,再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后,用氢氧化钠溶液校正pH至7.67.8,并加热煮沸10min,补充蒸馏水至1L,最后用滤纸过滤,呈清晰透明、淡黄色液体,经12115min灭菌备用。用法根据用途不同可以制成营养肉汤,以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基,加入琼脂1520g/L即可。质量控制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。保存置4冰箱内可以使用较长时间。注:商品牛肉浸
8、膏粉,一般使用量为35g/L。二、固体基础培养基1.营养琼脂用途一般细菌和菌株的纯化及传种。配法蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂粉(优质)12g,蒸馏水1L。将上述成分(除琼脂外)溶于水中,校正pH7.27.4后加入琼脂,煮沸溶解,根据用途不同进行分装,经121灭菌15min,倾注平板或制成斜面,冷藏备用。质量控制金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色;痢疾志贺菌菌落无色;铜绿假单胞菌菌落无色或浅绿色。保存置4冰箱保存,2周内用完。2.血琼脂培养基用途一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种。配法pH7.47.6牛肉浸液琼脂100ml,脱纤维羊血(或兔血)510ml。将血琼脂基础经121灭菌1
9、5min,待冷却至50左右以无菌手续加入羊血,摇匀后立即倾注灭菌平皿内,待凝固后,经无菌实验冷藏备用。质量控制化脓性链球菌ATCC19615生长良好,-溶血;肺炎链球菌ATCC6303生长良好,-溶血;表皮葡萄球菌ATCC12228生长良好,不溶血。保存置4冰箱,1周内用完。3.巧克力琼脂培养基用途主要用于嗜血杆菌的分离培养,亦可用于奈瑟菌的增殖培养。配法鲜牛肉浸出液1L,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂粉12g,无菌脱纤维羊血或兔血100ml。将上述成分(除兔血外)加热溶解,调pH至7.2,置12115min高压灭菌,待冷至约85,以无菌方式加入兔血,摇匀后置85水浴中,维持该温度10min,
10、使之成巧克力色。取出置室温冷至约50,倾注平板或制成斜面备用。质量控制流感嗜血杆菌ATCC10211、肺炎链球菌ATCC6305生长良好,菌落典型。保存置4冰箱,1周内用完。4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂用途常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。配法胱氨酸0.5g,胰化酪蛋白20g,氯化钠5g,亚硫酸钠0.3g,琼脂3.5g,酚红0.0175g,蒸馏水1L。将上述成分(酚红除外)混合溶解,调pH至7.2,加入酚红指示剂。分装试管,115灭菌15min。用法用于测定糖发酵时,按需要加入各种糖溶液,将待检标本直接种于培养基管内,置35孵箱,1824h观察结果。培养基由红色变
11、为黄色为阳性,不变色为阴性。第三节保存和增菌培养基一、菌种保存培养基配法蛋白胨10g,牛肉膏5g,氯化钠3g,磷酸氢二钠2g,琼脂粉4.5g,蒸馏水1L。将上述成分混合于水中,加热溶解,调pH至7.47.6,分装试管2/3左右高度,121高压灭菌15min,成为半固体培养基,备用。质量控制培养基呈淡黄色半固体状。大肠埃希菌(ATCC25922)生长良好,动力阳性;福氏志贺菌(ATCC12022)生长良好,动力阴性;金黄色葡萄球菌(ATCC25923)生长良好,动力阴性。二、增菌培养基1.葡萄糖肉汤用途用于血液增菌。配法蛋白胨(或月示胨)10g,氯化钠5g,肉浸液(或心浸液)1L,葡萄糖3g,枸
12、橼酸钠3g,5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml,1mol/L硫酸镁溶液20ml,青霉素酶1000U。将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解,再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁,继续煮沸5min,并补足失水,调整pH至7.8。过滤分装,每瓶50ml,高压灭菌11520min后,每瓶加入青霉素酶50U,经无菌试验合格后,冷却备用。用法将采取的血液标本,以无菌手续注入培养瓶中(血液1ml,培养液10ml),置35培养箱内,每天1次取出观察结果。如有细菌生长,可出现数种不同的表现,应随时作分离培养,可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。无细菌生长表现的培养瓶,需连续观察7d,仍无细菌生
13、长方可弃去。在观察的过程中,至少应作两次分离培养。注:枸橼酸钠为抗凝剂,可使血液加入培养基中不凝固。对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。本培养基近年来有许多改良配方,如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加营养;加0.2%核酸刺激细菌生长;加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面,保护细菌免受抗体破坏;加入聚茴香脑磺酸钠(SPS)能中和补体的抗药作用从而提高检出率。2.血液增菌培养基用途血液和骨髓液病原菌的增菌培养。配法蛋白胨10g,氯化钠5g,牛肉膏3g,葡萄糖1g,酵母膏粉3g,枸橼酸钠3g,磷酸氢二钾2g,5
14、g/L对氨基苯甲酸溶液5ml,1mol/L硫酸镁溶液20ml,4g/L酚红溶液6ml,青霉素酶50U,聚茴香脑磺酸钠(SPS)0.3g,蒸馏水1L。将上述成分(除酚红指示剂、青霉素酶外)混合加热溶解,校正pH至7.4,再加酚红,过滤分装每瓶3050ml,经121灭菌15min和3524h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.52.5U青霉素酶。质量控制伤寒沙门菌ATCC50096、白色念珠菌ATCC10231、化脓性链球菌ATCC19615、肺炎链球菌ATCC6305、金黄色葡萄菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853均生长良好。3.亚硒酸盐增菌培养基用途沙门菌增菌培养。配法蛋白胨5g,
15、乳糖4g,磷酸氢二钠4.5g,磷酸二氢钠5.5g,亚硒酸氢钠4g,蒸馏水1L。先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中,充分摇匀溶解。其它成分称量混合,加入蒸馏水800ml,加热溶解,待冷却后两液混合,充分摇匀,校正pH7.07.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15150mm的试管内,每管10ml。置水浴隔水煮沸1015min,立即冷却,置4冰箱保存备用。用法取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35培养过夜。如发现均匀混浊,管底有红色沉淀物,表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上,如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等,进行培养。质量控制培养基应呈淡黄色或无色
16、,透明无沉淀物。增菌灵敏度:伤寒沙门菌110-5,鼠伤寒及副伤寒沙门菌110-7。保存4保存,1周内用完。注:亚硒酸盐,包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用,但以亚硒酸氢钠效果为好。磷酸盐缓冲对中,两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试,其总量为10g/L。在制备过程中,亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间,否则亚硒酸盐会变质,生成红色沉淀物。培养基应呈淡黄色,有红色沉淀物出现时不可再用。4.SS增菌液用途用于沙门、志贺菌的增菌。配法月示胨2g,蛋白胨8g,牛肉膏3.5g,酵母膏2g,葡萄糖2g,枸橼酸铁10g,硫代硫酸钠10g,亚硫酸钠0.7g,胆盐5.5g
17、,磷酸氢二钠4g,磷酸二氢钾0.1g,去氧胆酸钠(进口)1.5g,煌绿0.005g,蒸馏水1L。将上述成分加热溶于水中,调pH至7.1,分装试管(15150mm),每管57ml,隔水煮沸5min备用。用法取粪便标本1g直接种于增菌液内,351618h培养,取出转种于分离培养基即可。质量控制培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。伤寒沙门菌ATCC50096、福氏志贺菌ATCC12022生长良好;大肠埃希菌ATCC25922生长抑制。注:切勿高压,隔水煮沸时间不超过5min。煌绿用量应根据不同产品批号酌情增减。5.碱性蛋白胨水用途霍乱弧菌增菌培养。配法蛋白胨20g,氯化钠5g,蒸馏水100ml。将上述成分
18、溶解于水中,校正pH至8.6,分装于试管810ml,经121灭菌15min备用。用法将待检标本接种到碱性胨水中,置35培养68h,霍乱弧菌呈均匀混浊生长,表面有菌膜出现。取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。质量控制有条件的实验室可用标准菌株,一般临床实验室可用非01群弧菌,培养后生长良好者方可使用。霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生长良好(6h);大肠埃希菌ATCC25922不生长(6h)。保存置4冰箱,2周内用完。注:若在每升碱性胨水中加入1%亚碲酸钾溶液0.51.0ml,则成为亚碲酸钾碱性胨水,其增菌效果更为理想。第四节分离培养基一、革
19、兰阳性杆菌分离培养基1.罗-琴改良培养基用途用于结核分枝杆菌培养。配法磷酸二氢钾2.4g,硫酸镁0.24g,枸橼酸镁(或枸橼酸钠)0.6g,天门冬素3.6g,甘油12ml,蒸馏水600ml,马铃薯淀粉30g,新鲜鸡卵液1L,2%孔雀绿水溶液20ml。先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油,加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉,边放边搅,并继续置沸水中加热30min,待冷却至60左右时,加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml,充分混匀后,用无菌操作分装于灭菌试管,每支56ml,塞紧橡皮塞(最好是翻口塞),置于血清凝固器内制成斜面,经851h间歇灭菌2次(或高压灭菌11520min),待
20、凝固后经无菌试验,4冷藏备用。用法取晨咳痰或其它体液标本,经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml(约2滴)滴种于培养基的斜面上,尽量摇晃,置355%10%二氧化碳温箱内培养14周,观察结果。凡在1周内发现生长的菌落,一般不可能是结核分枝杆菌;在2周后生长的菌落,奶油状,略呈黄色,粗糙突起,不透明,即取菌进行涂片染色镜检及鉴定。质量控制用结核分枝杆菌菌株作阳性培养试验。保存置4冰箱内24周有效。注:本培养基由Lowenstein-Jenden设计的基础上改良。(2)本培养基pH约为6.0左右,一般无须校正。(3)间歇灭菌的温度不宜超过90。2.血清斜面培养基(吕氏血清斜面)用途用于白喉棒状杆菌培
21、养。配法1%葡萄糖肉汤(pH7.6)100ml,无菌动物血清(牛、羊、猪、兔)300ml。将上述成分混合后,分装于试管内,每管约45ml。斜插在血清凝固器内(或蒸笼)加热808530min,使血清凝固成斜面,冷却后放4冰箱内。取出后采用间歇灭菌法,85灭菌30min,连续3天,经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。用法将喉拭子直接接种于上述斜面上,置35培养1624h。白喉杆菌在上述培养基上,菌落呈圆形,表面光滑、完整,9g/L氯化钠溶液中易乳化,用阿尔培脱染色,两极异染颗粒明显。注:所用血清不能含有防腐剂。该培养基不能高热灭菌,以防破坏其中营养成分。配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。3.亚碲酸
22、钾血琼脂用途用于分离白喉杆菌。配法蛋白胨10g,氯化钠5g,牛肉浸膏3g,葡萄糖2g,胱氨酸0.05g,1%亚碲酸钾45ml,脱纤维羊血100ml,琼脂2g,蒸馏水900ml。先将蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解,调pH至7.6,加入琼脂,高压灭菌11515min备用。待冷至50左右,用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血,混匀倾注平板。用法将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。置35孵箱,经2448h培养,观察结果。白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成黑色和灰黑色的菌落。二、革兰阴性杆菌分离培养基(一)弧菌分离培养基1.碱性琼脂用途用于霍乱弧菌分离培养。配法蛋白胨10g,氯
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