河蚬免疫活性糖蛋白分离及结构初步分析.pdf
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1、157工艺技术食品科学2008,Vol.29,No.11河蚬免疫活性糖蛋白分离及结构初步分析徐明生,曾婷婷,蒋 艳,杜华英(江西农业大学食品科学学院,江西 南昌 330045)摘 要:采用 DEAE-52 纤维素柱层析,SephadexG-75 葡聚糖凝胶层析和 RP-HPLC 柱层析手段分离纯化,从河蚬中分离纯化得到一种酸性糖蛋白 CFP。经 RP-HPLC 和 SDS-PAGE 测定,CFP 纯度为 94.74%,其相对分子量为19030D。经苯酚-硫酸法测定,CFP 的含糖量为 5.18%,蛋白质含量为 93.22%。碱性-消除反应表明,河蚬糖蛋白中存在 O-糖肽键。经红外光谱分析,CF
2、P 具有多糖的特征吸收,含有吡喃糖-型糖苷键。关键词:河蚬糖蛋白;分离纯化;结构鉴定Study on Isolation,Purification and Preliminary Structural Analysis ofImmunological Glycoprotein from Corbicula flumineaXU Ming-sheng,ZENG Ting-ting,JIANG Yan,DU Hua-ying(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural Universital,Nanchang 33004
3、5,China)Abstract:The glycoprotein from Corbicula fluminea was isolated and purified by the methods of EDAE-52 cellulose and SephadexG-75 column chromatography.The purity of the glycoprotein is 94.74%and its molecular weight is19030D by RP-HPLC andSDS-PAGE analysis.It has 5.18%sugar by phenol-sulfuri
4、c acid reaction and 93.22%protein by Bradford method.Alkaline-elimination reaction proved protein is covalently linked with carbohydrate by O-glycosyl linkage.The glycoprotein by IRanalysis shows the typical absorption of polysaccharide and the presence of pyranose-glycoside linkage is indicated.Key
5、 words:glycoprotein from Corbicula fluminea;isolation and purification;configuration analysis中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2008)11-0157-04河蚬(Corbicula fluminea)是双壳类软体动物,又称黄蚬、金蚶,扁螺等,广泛分布在我国湖泊、江河中,天然资源丰富1。河蚬是一种营养价值较高的贝类,传统中医认为河蚬肉味甘、咸、性寒,有清热、解毒、利湿、退黄、消肿的功效2;Kong3等证明河蚬的提取物具有增强巨噬细胞的吞噬活性作用;祝雯等4从河蚬水
6、溶性蛋白中分离纯化了一种命名为CFp-a 的碱性糖蛋白,四氮甲唑蓝(MTT)结果显示,CFp-a 对 BEL7404 癌细胞生长具有抑制作用;万细妹5等将河蚬经酶解后可提高清除羟自由基的能力,揭示了河蚬含有一定种类的生理活性物质。曾婷婷6等的研究表明河蚬中含有一定量的糖蛋白,但目前对河蚬中糖蛋白的分离和特性研究较少。所以,本实验对河蚬糖蛋白的分离纯化进行了初步研究,旨在为河蚬的保健和药用价值的深度开发应用提供依据和理论基础,这对低产值贝类的深加工,提升水产品附加值,促进河蚬养殖业的发展都具有重要的现实意义。收稿日期:2008-06-13基金项目:江西省科学技术厅重大技术攻关项目(2006-38
7、)作者简介:徐明生(1963-),男,教授,博士,研究方向为动物资源开发利用。E-mail:1材料与方法1.1材料、试剂与仪器河蚬糖蛋白粗提物 实验室自制;DEAE-52 纤维素 英国 Whatman 公司;Sephadex G-75 Pharmacia 公司;SDS;低分子量标准蛋白 美国 Amresco 公司;其余试剂均为分析纯。BS-100A自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司;DYY-III-12B电泳仪、DYY-III-24B电泳槽 北京六一仪器厂;STS-8A 转移脱色摇床、HD-21-88 紫外检测仪 上海琪特分析仪器有限公司;Breeze1525 高效液相色谱仪 美国 W
8、aters 公司;红外光谱仪 德国Bruker 公司;Multiskan MK 型酶标仪美国 Thermo 公司;SP-754PC 紫外分光光度计 上海光谱仪器公司。1.2方法1.2.1河蚬糖蛋白粗提物的制备6河蚬肉匀浆超声提取过滤、离心 60%90%硫酸铵盐析离心沉淀溶于蒸馏水 Sevag 法脱除游离蛋白离心旋转蒸发脱除残余溶剂透析、冷冻干 2008,Vol.29,No.11食品科学工艺技术158由图 1 可见,24 管、1015 管、2527 管、3133 管为蛋白质洗脱峰,26 管、817 管、2427 管、3032 管为多糖洗脱峰。其中 24 管为号峰、1015 管为号峰、2527 管
9、为号峰、3132 管为号峰,这四个洗脱峰在 280nm 和 490nm 处重叠,为糖蛋白的特征吸收,因此这四个洗脱峰组分可能都为糖蛋白,收集这四个组分,以体外促进小鼠脾淋巴细胞为筛选模型,活性检测预试验初步证明,1015 管(号峰)为主要的活性糖蛋白,透析,冻干后可进行下一步 SephadexG-75 纯化。活性糖蛋白(号峰)经SephadexG-75柱分离得到2个洗脱峰,如图 2 所示。由图 2 可见,在 280nm 和 490nm处的吸收峰重叠为 59 管为号洗脱峰和 1113 管为号峰,经体外促进小鼠脾淋巴细胞检测,号峰具有免疫活性,收集号峰,透析,冻干得白色粉末。燥粗提物1.2.2河蚬
10、糖蛋白的纯化将河蚬粗糖蛋白溶于双蒸水,上 DEAE-52 纤维素柱,上样量为 1ml,样液浓度为 100mg/ml,洗脱速度为 1ml/min,先采用双蒸水洗脱,然后依次换上 0.05、0.1、0.3 mol/ml 的 NaCl 溶液洗脱,用分部收集器收集,每管 5ml,紫外检测仪检测 280nm 处的吸光度,同时用苯酚-硫酸法检测 490nm 处的吸光度,收集蛋白质和多糖重叠的活性洗脱峰,收集液经水透析后冷冻干燥。将收集的上述糖蛋白溶液上 SephadexG-75 柱,上样量 0.5ml,样液浓度 20mg/ml,洗脱速度 0.5ml/min,蒸馏水洗脱,每 5min 收集一管,收集蛋白质和
11、多糖重叠的活性洗脱峰,冷冻干燥。冻干粉用超纯水溶解,上反相高效液相分离纯化。分离条件按文献7稍作修改:C18(Symmetry4.6 150mm),上样量 25l,样品浓度 120mg/ml,用含 0.1%三氟乙酸的乙腈(070%)进行梯度洗脱,采用紫外检测器在 280nm 处检测。1.2.3纯度检测经高效液相分离纯化的糖蛋白,采用 RP-HPLC 对其进行纯度鉴定,分析条件为:C18(Symmetry 4.6 150mm),进样量 10l,用含 0.1%三氟乙酸的乙睛(070%)进行梯度洗脱,用 280nm 紫外检测器检测,自动计算出糖蛋白纯度。1.2.4SDS-PAGE 电泳测定分子量采用
12、不连续凝胶电泳,浓缩胶浓度 3%,分离胶浓度 12%,浓缩胶缓冲液 pH6.8,分离胶缓冲液 pH8.8,低分子量标准蛋白为1440097000D。将待测糖蛋白用样品缓冲液溶解,沸水加热 35min。在浓缩胶中恒流25mA 电泳,待糖蛋白进入分离胶调电流至 40mA,恒流 3h。取下胶将其浸入染色液中染色 60min 后,浸入脱色液中用脱色摇床振荡脱色,中途更换脱色液数次8-9。1.2.5 紫外光谱分析按文献10方法,将糖蛋白溶于 0.2mol/L NaOH 水溶液中,于 45保温 3h,测定 200400nm 的紫外吸收值,同时测定未用碱处理的相同浓度糖蛋白的紫外吸收光 谱。1.2.6 红外
13、吸收光谱分析取河蚬糖蛋白 5mg,研细后加入 100mg 干燥 KBr 粉末,继续研细,于 10T/cm 压力下压成透明薄片,在红外光谱仪上描计红外光谱(5004000nm)。1.2.7 糖蛋白含量测定和糖含量测定蛋白含量采用考马斯亮蓝 G-250 法测定,糖含量采用苯酚-硫酸法测定。1.2.8促小鼠脾淋巴细胞试验参照 Mosmann11的方法改进,于 96 孔培养板分别加入 50ml/孔脾细胞悬液,实验组加入河蚬粗糖蛋白CFP-a 50ml/孔,空白对照组加 50ml/孔 RPMI-1640 完全培养液,共 100ml/孔,置于 37,5%CO2培养箱中培养 60h 后取出,于超净工作台上,
14、加浓度为 5mg/ml MTT10ml/孔,继续培养 4h 后,加 10%SDS-0.01mol/L HCl100ml/孔,于 37培养箱培养 2h 后,用酶标仪于 570nm测 O D 值。刺激指数 SI=试验组 OD570/空白对照组 OD5702结果与分析2.1 河蚬糖蛋白的分离纯化阴离子交换层析适用于分离各种中性、酸性、碱性糖蛋白。DEAE-52 装柱后,双蒸水平衡,洗脱条件上样量为1ml,样液浓度100mg/ml,洗脱速度1ml/min,先采用双蒸水洗脱,然后依次换上0.05、0.1、0.3mol/ml 的NaCl 溶液洗脱,用部分收集器收集,每管 5ml,紫外检测仪检测 280nm
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- 免疫 活性 糖蛋白 分离 结构 初步 分析
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