植物遗传转化技术幻灯片.ppt
《植物遗传转化技术幻灯片.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《植物遗传转化技术幻灯片.ppt(77页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、植物遗传转化技术第1页,共77页,编辑于2022年,星期一植物遗传转化植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株的过程。达的可育植株的过程。植物遗传转化植物遗传转化第2页,共77页,编辑于2022年,星期一植物遗传转化方法植物遗传转化方法第3页,共77页,编辑于2022年,星期一植物遗传转化常用的方法植物遗传转化常用的方法1 1、载载体体法法转转化化农农杆杆菌菌介介导导法法(TiTi质质粒)粒)22、非载体介导的遗传转
2、化、非载体介导的遗传转化(1 1)基因枪法)基因枪法(2 2)超声波法)超声波法(3 3)脂质体法(又称融合法)脂质体法(又称融合法)(4 4)电转化)电转化(5 5)花粉管转化)花粉管转化第4页,共77页,编辑于2022年,星期一将待转化的将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面,用特制枪沉淀在细小金属珠的表面,用特制枪将金属珠直接打入植物细胞,枪的威力为将金属珠直接打入植物细胞,枪的威力为430 m/s,植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶片等,但进去植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶片等,但进去的的DNA片段整合效率极低。片段整合效率极低。1 基因枪转化法基因枪转化法第5页,共77页,编辑于
3、2022年,星期一将高浓度的质粒将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体加入到植物细胞的原生质体悬浮液中,混合物在悬浮液中,混合物在 200-600V/cm 的电场中处的电场中处理若干秒,然后将原生质体在组织培养基中生长,理若干秒,然后将原生质体在组织培养基中生长,再生出整株植物。再生出整株植物。2 电击法电击法第6页,共77页,编辑于2022年,星期一 将外源将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合,与特殊的疏水性高分子化合物混合,在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体,在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体,后者与植物细胞原生质体融合,筛选融合子,再生后者与植物细胞原生质体融
4、合,筛选融合子,再生植物细胞壁。植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题,即:原生质体再生出整株植物比较难。个难题,即:原生质体再生出整株植物比较难。3 融合法融合法第7页,共77页,编辑于2022年,星期一 外源外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中,从而实现常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中,从而实现基因的转移。基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的,这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的,目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬目前已
5、应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。菜等作物的转基因研究。4 花粉管导入法花粉管导入法第8页,共77页,编辑于2022年,星期一花粉管导入法的特点是花粉管导入法的特点是直接直接、简便简便。受体材料为植株整体受体材料为植株整体,省略了细胞组织培养,省略了细胞组织培养的诱导和传代过程,排除了植株再生的障碍,的诱导和传代过程,排除了植株再生的障碍,特别适合于难以建立有效再生系统的植物。特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞,早期胚胎细胞,导入的导入的DNADNA分子整合效率较高。分子整合效
6、率较高。第9页,共77页,编辑于2022年,星期一 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤,这是由于植物根部被一种革兰氏阴常会形成根瘤,这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌(性土壤杆菌农杆根瘤菌(A.tumefaciens)感染所)感染所致,其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型致,其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。)质粒介导的。5 农杆菌介导农杆菌介导第10页,共77页,编辑于2022年,星期一植物遗传转化载体植物遗传转化载体第11页,共77页,编辑于2022年,星期一作为植物
7、遗传转化的载体,必须具有两种功能:作为植物遗传转化的载体,必须具有两种功能:1.1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去,并且它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去,并且整合到宿主细胞的基因组整合到宿主细胞的基因组DNADNA上;上;2.2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNADNA序列。序列。第12页,共77页,编辑于2022年,星期一 人人们们很很早早就就发发现现双双子子叶叶植植物物常常发发生生一一种种冠冠瘿瘿瘤瘤病病,该该病病在在法法国国、东东欧欧和和意意大大利利的的葡葡萄萄和和果果树树上上曾曾大大面面积发生。积发生。1907年年首
8、首先先发发现现这这种种冠冠瘿瘿瘤瘤病是由根癌农杆菌引发的。病是由根癌农杆菌引发的。农杆菌的农杆菌的TiTi质粒质粒第13页,共77页,编辑于2022年,星期一电镜下的根癌农杆菌电镜下的根癌农杆菌冠瘿瘤冠瘿瘤第14页,共77页,编辑于2022年,星期一1974年年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒(大于种与肿瘤诱导有关的大型质粒(大于200kb),称),称为为Ti质粒质粒。第15页,共77页,编辑于2022年,星期一19771977年年ChiltonChilton等在研究农杆菌侵染后形成的等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞植物肿
9、瘤细胞时,时,用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌TiTi质粒的一个片段,称质粒的一个片段,称为为T-DNAT-DNA(Transfer-DNATransfer-DNA)。实验表明,实验表明,T-DNAT-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达,从而导致了冠瘿瘤的发生。表达,从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现,进一步研究发现,整合到整合到植物基因组中的植物基因组中的T-DNAT-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代。后代。TiTi质粒的上述特性成为农杆菌介导法植
10、物遗传转化的重要基质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。础。第16页,共77页,编辑于2022年,星期一第17页,共77页,编辑于2022年,星期一TiTi质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质;质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质;双股共价闭合的环状双股共价闭合的环状DNADNA分子;分子;T-DNAT-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表达;能够插入到植物基因组中并能稳定表达;长度长度150-200KB150-200KB;植物基因工程常用的载体。植物基因工程常用的载体。第18页,共77页,编辑于2022年,星期一根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合
11、成的冠瘿碱种类不同分:种类不同分:章鱼碱型(章鱼碱型(octopineoctopine)胭脂碱型(胭脂碱型(nopalinenopaline)农杆碱型(农杆碱型(agropineagropine)琥珀碱型(琥珀碱型(agrocinoineagrocinoine)第19页,共77页,编辑于2022年,星期一章鱼碱的遗传图胭脂碱的遗传图第20页,共77页,编辑于2022年,星期一Ti质粒结构质粒结构T-DNAT-DNA区、毒性区区、毒性区(vir)(vir)、质粒复制起点、质粒复制起点(ori)(ori)、质粒结合转移、质粒结合转移位点位点(con)(con)、冠瘿碱分解位点、冠瘿碱分解位点(oc
12、s or nos)(ocs or nos)TiTi质粒结构质粒结构第21页,共77页,编辑于2022年,星期一左边界左边界LBLB右边界右边界RBRB生长素合成基因生长素合成基因细胞分裂素合成基因细胞分裂素合成基因冠瘿碱合成基因合成基因冠瘿碱合成基因合成基因VirVir基因基因复制起始位点复制起始位点ConCon区区OncOnc基因基因第22页,共77页,编辑于2022年,星期一VirVir区(毒性区):区(毒性区):与与T-DNAT-DNA区彼此相邻,约占区彼此相邻,约占TiTi质粒总长质粒总长度的度的1/31/3;该区段上的基因与该区段上的基因与T-DNAT-DNA从细菌转移到植物细胞的遗
13、传过程有从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关,区段上的基因能够使农杆菌表现毒性;关,区段上的基因能够使农杆菌表现毒性;VirVir区段总长度约区段总长度约35kb35kb,由,由7 7个互补群组成;个互补群组成;毒性区中各位点的表达情况分为两种:毒性区中各位点的表达情况分为两种:组成性表达组成性表达植物诱导性表达植物诱导性表达第23页,共77页,编辑于2022年,星期一VirVir基因的功能基因的功能:n诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上 VirAVirA蛋蛋白白;n产物诱导产物诱导T-DNAT-DNA形成单股形成单股DNADNA片段片段-VirDVirD蛋
14、白蛋白;n将将T-DNAT-DNA转入植物细胞,整合到寄主基因组中转入植物细胞,整合到寄主基因组中-VirDVirD、E E蛋白蛋白;nT-DNAT-DNA基因被表达,使植物细胞增殖并产生冠瘿基因被表达,使植物细胞增殖并产生冠瘿碱。碱。第24页,共77页,编辑于2022年,星期一T-DNAT-DNA(Transfer DNATransfer DNA)是农杆菌侵入植物细胞时从是农杆菌侵入植物细胞时从TiTi质粒上转移到植物质粒上转移到植物细胞的一段细胞的一段DNADNA;T-DNAT-DNA两端个有一段两端个有一段25bp25bp的同向重复序列,是的同向重复序列,是T-T-DNADNA的边缘区。
15、的边缘区。LBLB;RBRB在同一条单链的在同一条单链的LBLB和和RBRB内各形成一个缺口,单链内各形成一个缺口,单链T-DNAT-DNA进入植物细胞进入植物细胞第25页,共77页,编辑于2022年,星期一损伤的植物根部会分泌出损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸,它们能诱导香酸,它们能诱导Ti质粒上质粒上的的vir基因基因以及根瘤菌染以及根瘤菌染色体上的色体上的一个操纵子一个操纵子表达。表达。vir基因产物将基因产物将Ti质粒上的质粒上的T-DNA单链切下,而根瘤单链切下,而根瘤菌染色体上的操纵子表达菌染色体上的操纵子表达产物则与单链产物则与单链T-DNA
16、结合结合形成复合物,后者转化植形成复合物,后者转化植物根部细胞。物根部细胞。Ti 质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制第26页,共77页,编辑于2022年,星期一T-DNA的染色体整的染色体整合机制合机制第27页,共77页,编辑于2022年,星期一T-DNA的染色体整合的染色体整合机制机制第28页,共77页,编辑于2022年,星期一目的基因目的基因中间表达载体中间表达载体改良的改良的TiTi质粒质粒转化载体系统转化载体系统一元载体系统一元载体系统双元载体系统双元载体系统TiTi质粒质粒天然天然TiTi质粒存在的缺陷质粒存在的缺陷中间表达载体的特性中间表达载体的特性卸甲载体卸甲载体构构 建建第2
17、9页,共77页,编辑于2022年,星期一存在缺陷存在缺陷TiTi质粒分子量过大,一般在质粒分子量过大,一般在160160240kb240kb,在基因工程中,在基因工程中难以操作;难以操作;很难找到单一的酶切位点;很难找到单一的酶切位点;生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物;素阻止了细胞再生长为整株植物;TiTi质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增,不能在大肠质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增,不能在大肠杆菌中复制。杆菌中复制。TiTi质粒上还存在一些对于质粒上还存在一些对于T-DNAT-DNA转移不起任何
18、作用的基因。转移不起任何作用的基因。第30页,共77页,编辑于2022年,星期一1、除去除去T-DNA上的生长素(上的生长素(tms)和分裂素()和分裂素(tmr)生物合)生物合成基因成基因,因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为,因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物;整株植物;2、除去除去T-DNA上的有机碱生物合成基因上的有机碱生物合成基因(tmt);因为有机);因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸,影响植物细胞的生长;碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸,影响植物细胞的生长;3、除去、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列,最大限度地质粒上的其它非必需序列,最大限度地缩短载体缩
19、短载体的长度的长度;4、安装大肠杆菌复制子安装大肠杆菌复制子,使其能在大肠杆菌中复制,以利,使其能在大肠杆菌中复制,以利于克隆操作;于克隆操作;5、安装植物细胞的筛选标记安装植物细胞的筛选标记,如,如 neor 基因,使用植物基因基因,使用植物基因的启动子和的启动子和polyA化信号序列;化信号序列;6、安装多聚人工接头安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。以利于外源基因的克隆。Ti 质粒的改造质粒的改造第31页,共77页,编辑于2022年,星期一TiTi质粒的改造质粒的改造-去除致瘤基因去除致瘤基因OncOnc由于影响植株再生的直接原因是由于影响植株再生的直接原因是T-DNAT-DNA中的中
20、的OncOnc基因的致瘤基因的致瘤作用,因此,切除其致瘤基因,使成为无毒的质粒,即作用,因此,切除其致瘤基因,使成为无毒的质粒,即“卸卸甲甲”、“解除解除”、“缴械缴械”其其“武装武装”的的TiTi载体,记为载体,记为Onc-Onc-,构建的,构建的Onc-Onc-载体叫载体叫“卸甲载体卸甲载体”。卸甲载体:卸甲载体:构建无毒的构建无毒的TiTi质粒载体质粒载体例:例:pGV3850:pGV3850:是从胭脂碱是从胭脂碱TiTi质粒质粒PTIC58PTIC58衍生而来的衍生而来的第32页,共77页,编辑于2022年,星期一TiTi质粒的其他部分质粒的其他部分右边界右边界(RB)胭脂合成酶基因(
21、胭脂合成酶基因(NosNos)pBR322(含含AMPr)左边界左边界(LB)卸甲载体卸甲载体第33页,共77页,编辑于2022年,星期一中间表达载体中间表达载体中间载体:中间载体:带有带有重组重组T-DNAT-DNA的的大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒的衍生载体的衍生载体称为称为”中间载体中间载体”原理:原理:大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性转移的特性 目的:目的:把预先进行亚克隆、切除、插入或置把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的换的T-DNAT-DNA引入引入TiTi质粒中质粒中。第34页,共77页,编辑于2022年,星期一中间表达载体:中间表达载体:是
22、由是由中间载体中间载体(含选择标记含选择标记)加上能在植物细胞中表达的加上能在植物细胞中表达的启动子启动子及及目的基因目的基因构成,也就是嵌合基因插入中间载体后构成。构成,也就是嵌合基因插入中间载体后构成。嵌合基因(嵌合基因(chimeric genechimeric gene)就是来自两种或两种以上生物的启动子、就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。结构基因、终止子连接在一起构成基因。第35页,共77页,编辑于2022年,星期一中间表达载体中间表达载体-启动子及调控序列启动子及调控序列 TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒 NosNosNosNos、OcsOcs
23、OcsOcs等基因具有与真核生物启动子类似的等基因具有与真核生物启动子类似的等基因具有与真核生物启动子类似的等基因具有与真核生物启动子类似的TATATATATATATATA盒和盒和盒和盒和CAATCAATCAATCAAT盒,均能在植物细胞中表达,并且无组织特异盒,均能在植物细胞中表达,并且无组织特异盒,均能在植物细胞中表达,并且无组织特异盒,均能在植物细胞中表达,并且无组织特异性。因此,它们成为早期构建嵌合基因的启动子,其中性。因此,它们成为早期构建嵌合基因的启动子,其中性。因此,它们成为早期构建嵌合基因的启动子,其中性。因此,它们成为早期构建嵌合基因的启动子,其中以以以以NosNosNosN
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 植物 遗传 转化 技术 幻灯片
限制150内