《子克隆的载体》PPT课件.ppt
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1、第三章第三章 分子克隆的载体分子克隆的载体质粒(plasmid)噬菌体或病毒DNA考斯质粒(cosmid)与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征n载体的定义载体的功能及特征将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体(vector)n载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件n载体的特征l分子较小,可携带比较大的DNA片段。l能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。l要有尽可能多种限制酶的切割位点,但每一种限制酶又要最少的切割位点(多克隆位点multiplecloningsites,MCS)。l有合适的选择标记,易于筛选。
2、l有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可能是高效的表达。l从安全角度考虑,要求载体不能随便转移,仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。n基因克隆利用重组DNA技术分离目的基因,称为基因克隆(geneclone)克隆(clone)动词:指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程。名词:指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的群体。n基因文库genelibrary由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称为基因文库(genelibrary)功能功能克隆载体克隆载体:克隆一个基
3、因或克隆一个基因或DNADNA片段片段表达载体表达载体:用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体:把一个基因插入到染色体把一个基因插入到染色体组中组中载体的分类载体的分类来源:来源:质粒载体质粒载体plasmidplasmid 噬菌体载体噬菌体载体phagephage 柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmidcosmid 真核细胞克隆载体真核细胞克隆载体载体的种类和特征载体的种类和特征载体种类受体细胞结构插入片断举例质粒*E.coli环状8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列,gt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状10k
4、bM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体,昆虫杆状病毒载体穿
5、梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒,PBV,Ti质粒第一节第一节 质粒(质粒(plasmid)载体)载体l质粒是一种独立于染色体外的遗传因子,可自身复质粒是一种独立于染色体外的遗传因子,可自身复制和表达(但依赖于宿主编码的酶和蛋白质)制和表达(但依赖于宿主编码的酶和蛋白质)一、质粒的基本特征质粒的基本特征l大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlentlyclosedcircleDNA,cccDNA),少数为线性少数为线性l大小为大小为1-200kb1-200kb,也有更大,也有更大1.质粒的基本概念质粒的基本概念l常见于原核细菌和真菌
6、中常见于原核细菌和真菌中 一、质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的表型质粒的表型:抗生素的抗性,产生抗生素、降解复:抗生素的抗性,产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素(如大肠杆菌素、肠毒素)杂有机化合物、产生毒素(如大肠杆菌素、肠毒素)、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等克隆克隆的的质粒载体质粒载体 允许外源的允许外源的DNADNA插入,储存。主要是插入,储存。主要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源允许外源DNADNA的插入、的插入、储存和表达。储存和表达。质粒DNA的构型:SC型共价闭
7、合环形DNA(cccDNA)OC型开环DNA(opencircularDNA,ocDNA)L型线性DNA(linearDNA,LDNA)作为载体的质粒都含有三种共同的组分:复制基因(replicator)选择性记号 克隆位点 LOCSC2.质粒的基本特征质粒的基本特征1)质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型:松弛型复制控制的质粒10-60拷贝relaxedplasmid严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringentplasmid2 2
8、)质粒的不相容性)质粒的不相容性plasmidsincompatibility是指在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密切的不同质是指在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在第二个质粒导入后,在不涉及在第二个质粒导入后,在不涉及DNA限制系统时出现的现限制系统时出现的现象。象。质粒的不相容性分子基础,主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。不相容的质粒一般都利用同一复制系统,从而导致不能共存不相容的质粒一般都利用同一复制系统,从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞
9、中复制时,于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时,在分配到子细胞的过程中会竞争,随机挑选,微小的差异在分配到子细胞的过程中会竞争,随机挑选,微小的差异最终被放大,从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。最终被放大,从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。不相容群不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体,一般指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体,一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相多个不相容群,如容群,如ColE1和和pMB1,pSC101和和p15A。AB3 3)质粒的可转移性)质粒的可转移性transferring在自然
10、条件下,很多在自然条件下,很多质粒可通过称为细菌接合质粒可通过称为细菌接合(conjugation)的作用转移到新的宿主细胞内。)的作用转移到新的宿主细胞内。要素:要素:移动基因mob,转移基因tra,顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。4)携带特殊的遗传标记)携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这是寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义标记基因标记基因markergene选择标记基因选择标记基因selectivemark
11、ergene用于鉴别目标用于鉴别目标DNADNA的存在,将成功转化了质粒的宿的存在,将成功转化了质粒的宿主挑选出来主挑选出来抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记 氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistancegene,ampr)四环素抗性基因(Tetracyclineresistancegene,tetr)氯霉素抗性基因(chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat)卡那霉素和新霉素抗性基因(kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor)琥珀突变抑制基因 supF在基
12、因的编码区中,若某个密码子发生突变后变成终止密码子,则称这样的突变为赭石突变(突变为UAA),或琥珀突变(突变为UAG),或乳白突变(突变为UGA)。supF基因编码细菌的抑制性tRNA,可在UAG密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr基因和ampr基因,只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。正向选择标记,表达一种使某些宿主菌致死的基因产物,而含有外源基因片段插入后,该基因便失活。如蔗糖致死基因SacB,来自淀粉水解芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死
13、的,因此该基因可用于插入失活筛选重组子。筛选标记基因筛选标记基因主要用来区别主要用来区别重组质粒与非重组质粒重组质粒与非重组质粒,当一个外,当一个外源源DNA片段插入到一个质粒载体上时,可通片段插入到一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。组质粒。uu-互补互补uu插入失活插入失活-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶(-galactosidase,由 1024 个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
14、uu-互补互补lacZ 基因是乳糖lac操纵子中编码-半乳糖苷酶的基因,乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖既是lac 操纵子的诱导物,也是作用的底物。IPTG:异丙基-D-硫代半乳糖苷,乳糖的衍生物,可作为lac 操纵子的诱导物,但不能作为反应的底物;X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,可作为lac 操纵子的底物,但不能作为诱导物。X-gal可作生色剂,被-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物,可使菌落或噬菌斑呈兰色。乳糖操纵子乳糖操纵子(lacoperon)的结构的结构调控区调控区调节基因调节基因启动序列启动序列操纵序列操纵序列结构基因结构基因Z:-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y:透酶透酶A
15、:乙酰基转移酶:乙酰基转移酶ZYAOPDNA功能互补uu插入失活插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322,该质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后,导致tetr基因失活,变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。二、质粒载体的种类质粒载体的种类1.pBR322之前之前2.天然质粒:天然质粒:没有经过以基因克隆为目标没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中,常见的可用于基因克隆的天在大肠杆菌中,常见的可用于基因克隆的天
16、然质粒有然质粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等,等,但存在一定的局限性。但存在一定的局限性。分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等转化效率与质粒大小成反比,质粒15kb,转化效率成为限制因素质粒越大,越难用限制性酶切进行鉴定。质粒越大,拷贝数越低2.pBR322之后之后调整载体的结构,提高载体的工作效率调整载体的结构,提高载体的工作效率pBR322pUC系列质粒系列质粒去掉多余片段,提供多克隆位点,筛选标去掉多余片段,提供多克隆位点,筛选标记记增加辅助功能,表达载体(增加辅助功能,表达载体(expressionvector),穿梭载体(),穿梭载体(shuttlev
17、ector)3.克隆载体1)pBR322质粒载体松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆以Ampr和Tetr为选择性标记,克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子,可通过插入失活来进行筛选2)pUC18/19质粒载体来自来自pBR322拷贝数拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序装有多克隆位点(装有多克隆位点(MCS)正选择颜色标记正选择颜色标记lacZ -互补互补3)pUC118/119质粒载体由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来,大小为3162bp,相当于在pUC18/19中增加了
18、带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。用途:制备单链DNA用于:DNA序列测定、定点诱变、制备探针4)pGEM-3Z/4Z质粒载体由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来,大小为2.74kb与pUC18/19相比,在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子,如Sp6和T7噬菌体的启动子。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。用途:体外转录得到RNA,用于体外蛋白质的合成或用作克隆邻近DNA片段的探针5)多功能质粒载体在上述载体的基础上,人们设计出一些多功能的质粒载体,这类质粒载体综合了以上质粒的特点。除了作为质粒载体基本
19、要素外,综合了上述功能要素,如多克隆位点、-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有 pBluescriptKS(),这类质粒一般由 4 个质粒组成一套系统,其差别在于多克隆位点方向相反(根据多克隆位点两端 Kpn 和 Sac 的顺序,用 KS 或 SK 表示),或单链噬菌体的复制启始方向相反(或者说,引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA,用+或-表示)4.表达载体expressionvector该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的,主要增添了强启动子,以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件,如PET系列载体。详细情况见后文第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载
20、体phagevectors头部尾管尾锥尾丝C、B、D、E分别指相应基因编码的颗粒蛋白一、噬菌体的分子生物学噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体,在感染宿主后可进入溶源状态,也可进入裂解循环。基因组 双链 DNA 分子,实际大小为 48502bp 在噬菌体颗粒内,基因组 DNA 呈线性,其两端的 5末端带有 12 个碱基的互补单链(粘性末端)当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后,其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子,而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶(gyrase)作用下,形成封闭的环状 DNA 分子,充当转录的模板此时,噬菌体可选择进入裂解生长状态(lyticgrowth),大量
21、复制并组装成子代噬菌体颗粒,导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环,释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒(每个细胞)或者进入溶源状态(lysogenicstate),将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中,并随宿主的繁殖传给子代细胞感染周期/溶原溶源阶段溶源阶段(整合到寄主整合到寄主染色体上染色体上)裂解阶段裂解阶段 (复制和释放复制和释放)噬菌体基因组至少可编码 30 个基因,它们的分布和排列与其功能有一定关系根据执行功能的不同可将基因组分为三个区:左边区域包括从基因 Nu1 到基因 J 之间的基因,其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的
22、形成。中间区域(基因 J 右边至 gam)编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多基因对裂解生长是非必须的,在构建载体时可以去掉,用外源 DNA 片段替代。右边区域(基因 gam 右边至基因 Rz)包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。3333溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制基因合成控制基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因coscos-DNA头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGGCOSCCCG
23、CCGCTGGA 5CCCGCCGCTGGA 5 COS噬菌体生物学特性:噬菌体生物学特性:生物结构生物结构(一)噬菌体的发育调节1吸附(adsorption)2立即早期转录(immediate early transcription)3延迟早期转录(delayed early transcription)4溶源和裂解的感染分化5进入裂解生长6溶源化(二)噬菌体的可取代区在溶源状态,噬菌体DNA整合在半乳糖代谢基因gal和生物素合成基因bio之间。噬菌体在某些条件下,会从宿主染色体上切离出来,进入裂解循环。切离和整合是相互对立的过程,在不同重组酶的作用下,导致切离或整合的发生。1.区域溶源化噬
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