ELISA试剂盒实验教程.ppt
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1、ELISA ELISA 知识简介知识简介南京金益柏生物技术有限公司 Tel:025-86228208 Fax:025-86228208 Web: 原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.ELISA的原理的原理2.ELISA的类型的类型3.试剂准备试剂准备:免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物的准备酶底物的准备 4.对照设定对照设定5.标本的采取和保存标本的采取和保存6.结果判断结果判断 原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果 ELISA ELISA是一种免疫测定(是一种免疫测定(immunoassayimmunoassay,IAIA)。基础。基础:抗
2、抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。1.ELISA的原理的原理原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联免疫年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(吸附剂测定(Enzyme Linked ImmunoSorbent A
3、ssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简称),简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为:平衡,其反应式为:Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力(抗体的亲和力(aff
4、inityaffinity),可以用平衡常数),可以用平衡常数K K表示:表示:K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。均能保持原有的结构和活性。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的
5、结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系,具有高度的特异性。之间。化学结构和空间构型互补关系,具有高度的特异性。测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果最适比例最适比例 原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可
6、提高数千倍,达标记的免疫敏感度可提高数千倍,达ng/mlng/ml水平水平例如,例如,HBsAgHBsAg,其敏感度可达,其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果1.41.4免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广。检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广。原理原理类型
7、类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2 2ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:法中有三个必要的试剂:(1 1)固相的抗原或抗体,即)固相的抗原或抗体,即 免疫吸附剂免疫吸附剂(immunosorbentimmunosorbent);(2 2)酶标记的抗原或抗体,称为)酶标记的抗原或抗体,称为 结合物结合物(conjugateconjugate);(3 3)酶反应的底物。)酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。原理原
8、理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于用于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.2 2.2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检
9、标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用本法。本法关的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。适的标记方法。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.3 2.2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法
10、。建立检测相应抗体的方法。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.4 2.2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。抗原时,可用此法检测特异性抗体。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.5 2.2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争
11、法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测测定多用此法。定多用此法。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.6 2.2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被固相,抗体包被固相,以捕获血清标本中的以捕获血清
12、标本中的IgMIgM(其中包括针对抗原的特异性(其中包括针对抗原的特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM)。)。此法常用于病毒性感染的早期诊此法常用于病毒性感染的早期诊断。断。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法:固相支持物;:固相支持物;:样品;:样品;:特异性:特异性IgGIgG;:生物素化抗小鼠:生物素化抗小鼠IgG IgG(BiotinBiotin););:辣根过氧化物酶:辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素(酶标链亲和素(AvidinAvidin););:DABDAB显色
13、液;显色液;:显色;:显色;原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.ELISA3.ELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分)ELISAELISA中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物。底物。(1 1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);(2 2)酶标记的抗原或抗体(结合物);)酶标记的抗原或抗体(结合物);(3 3)酶的底物;)酶的底物;(4 4)阴性对照品和阳性对照品,参考标准品;)阴性对照品和阳性对照品,参考标准品;(5 5)结合物及标本的稀释液;)
14、结合物及标本的稀释液;(6 6)洗涤液;)洗涤液;(7 7)酶反应终止液)酶反应终止液原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。但空白值也略高。良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附性能好,空白值低空白值低,
15、孔底透明孔底透明度高度高,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相性能相近近。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子团间的作用。这种物理吸
16、附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的通常含有更多的疏水基团疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。,故更易吸附到固相载体表面。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和
17、素先包被载体,加入生物素化的即用亲和素先包被载体,加入生物素化的DNADNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入中溶解后加入ELISAELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。优点:试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦优点:试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复
18、性亦佳。抗原用量少,仅为直接包被的佳。抗原用量少,仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果包被用抗原:包被用抗原:天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体量太小,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固
19、相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。的吸附,间接地结合到固相载体表面。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力,其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力,其联结发生在FcFc段上,抗体结合段上,抗体结合点暴露于外。点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能须除去杂抗体后才能用于用于ELISAELISA,以保证试验的特异性。,以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收层析
20、处理,直接包被。在某些情况下,用多种单抗混合包被,层析处理,直接包被。在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。可取得更好的效果。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。加入包被液后,在加入包被液后,在4-84-8冰箱中放置过夜,冰箱中放置过夜,3737中保温中保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大
21、的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.1.6 3.1.6 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥空隙,从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物
22、质的再吸附。常用封闭剂:常用封闭剂:0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA;10%BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶;脱脂奶粉脱脂奶粉,比较价廉,可以高浓度使用(比较价廉,可以高浓度使用(5%5%)。)。所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭?固相均需封闭?原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.4 3.4 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中,常用的稀释液为含中,常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷磷酸盐缓冲液。酸盐缓冲液。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果ELISA的试剂准备的试剂准
23、备B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标记的抗体(或抗原)是即酶标记的抗体(或抗原)是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体(或抗原)的免疫活性抗体(或抗原)的免疫活性 3 3含有或少含有游离的抗体(或抗原)含有或少含有游离的抗体(或抗原)4 4结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG,以免在与酶联结时其,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用
24、层析纯化的抗体,这样全部酶结他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡。在实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多,总中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的。的要求是抗原必须是高纯度的。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照对照标本标本结果结果酶酶纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格不贵,受检标本中不存在相同的酶。丰富,价格不贵,受检标本中不存在相同的酶。酶结合
25、物保留活性部分和催化能力,底物易于制备和保存,酶结合物保留活性部分和催化能力,底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等。价格低廉,有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中,中,HRPHRP,APAP,葡萄糖氧化酶,葡萄糖氧化酶,-D-D-半乳糖苷酶和脲半乳糖苷酶和脲酶等。酶等。HRPHRP是一种糖蛋白,含糖量约为是一种糖蛋白,含糖量约为18%18%,分子量为,分子量为4400044000,是一种,是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一种卟啉蛋白质。是一种卟啉蛋白质。原理原理类型类型试剂试剂准备准备对照
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