《生物技术原理》PPT课件.ppt
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1、 第五章第五章 生物技术原理生物技术原理 2121世纪是生命科学与生物技术的世纪,生物技术被世界各国视为世纪是生命科学与生物技术的世纪,生物技术被世界各国视为一项高新技术,广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工一项高新技术,广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业,正在对人类社会生活产生深远影响。能源等各行各业,正在对人类社会生活产生深远影响。传统生物技术传统生物技术:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶现代生物技术现代生物技术:20:20世纪世纪7070年代末年代末8080年代初年代初,基因工程基因工程 生物技术生物技术生生物物技技术术也也称称为为生生
2、物物工工程程,是是指指以以现现代代生生命命科科学学为为基基础础,结结合合其其它它基基础础学学科科的的科科学学原原理理,采采用用先先进进的的工工程程技技术术手手段段,改改造造或或重重新新设设计计细细胞胞的的遗遗传传物物质质,按按照照预预先先的的设设计计改改造造生生物物体体,获获得得优优良良品品质质的的动动物物、植植物物和和微微生生物物品品系系,或或加加工工生生物物原原料料,为为人人类类生生产产出出所所需需产产品品,达达到到提高社会生产力和生活质量的目的。提高社会生产力和生活质量的目的。基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程蛋白质工程蛋白质工程生物技术生物技术第一节第一节 基
3、因工程操作原理基因工程操作原理第二节第二节 细胞工程操作原理细胞工程操作原理第三节第三节 酶工程酶工程第四节第四节 发酵工程发酵工程第五节第五节 蛋白质工程蛋白质工程第六节第六节 分子杂交与遗传标记分子杂交与遗传标记 生物技术的发展日新月异,新成果层出不穷,了解生物技术生物技术的发展日新月异,新成果层出不穷,了解生物技术原理有利于理解和利用生物技术为社会服务。原理有利于理解和利用生物技术为社会服务。旨在通过本章的学习,达到了解生物技术基本原理的目的。旨在通过本章的学习,达到了解生物技术基本原理的目的。第一节第一节 基因工程操作原理(基因工程操作原理(P133P133)n一、什么是基因工程一、什
4、么是基因工程n二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理一、一、什么是基因工程什么是基因工程v概念概念:也叫也叫基因操作基因操作遗传工程遗传工程重组重组DNA技术技术v基因工程主要原理基因工程主要原理v基因工程四个步骤基因工程四个步骤用人工方法,把生物的遗传物质分离出来,在体外用人工方法,把生物的遗传物质分离出来,在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表进行基因切割、连接、重组、转移和表达的技术。达的技术。克隆目的基因,取得所需要的克隆目的基因,取得所需要的DNA特异片段。特异片段。与与DNA载体连接成重组载体连接成重组DNA。引入细菌或动植物细胞并使其增殖。引入细菌或动植物细胞并使
5、其增殖。挑选出受体细胞,指导合成蛋白质或优良新品种。挑选出受体细胞,指导合成蛋白质或优良新品种。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(一)核酸分子的提取技术(一)核酸分子的提取技术(二)电泳技术(二)电泳技术(三)各种酶的使用(三)各种酶的使用(四)基因克隆(四)基因克隆(五)体外重组(五)体外重组(六)载体构建(六)载体构建(七)转化(七)转化(八)重组体的筛选与鉴定(八)重组体的筛选与鉴定(九)培育新型品种(九)培育新型品种二、基因工程操作技术及原理二、基因工程操作技术及原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理v分类:分类:v方法:方法:(一)核酸分子的提取技术(一)核
6、酸分子的提取技术RNARNA的提取的提取总总DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 首先首先,粉碎组织细胞;,粉碎组织细胞;其次其次,DNADNA用乙醇等进行沉淀;用乙醇等进行沉淀;最后最后,用苯酚、氯仿等洗涤,用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。纯化。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(二)电泳技术(二)电泳技术带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种生物大分子在一定各种生物大分子在一定pHpH值条件下,可以解离成带值条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。
7、v分类:分类:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。场凝胶电泳。v概念:概念:第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理总总RNARNA总总DNADNA质粒质粒DNADNA第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(三)各种酶的使用(三)各种酶的使用1 1、限制性内切酶的使用、限制性内切酶的使用v分类分类:型酶、型酶、型酶型酶和和型酶。型酶。v概念概念:是一类能识别是一类能识别双链双链DNADNA中特殊核苷酸序中特殊核苷酸序列,并在合适的条件下列,并在合适的条件下使每一条链一定位点上
8、使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开,产的磷酸二酯键断开,产生具有生具有3-OH3-OH基团和基团和5-P5-P基团的基团的DNADNA片段的片段的内切脱氧核糖核酸酶内切脱氧核糖核酸酶。用用质粒质粒构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子用用噬菌体噬菌体DNADNA构建构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理重组重组DNADNA分子分子限制性内切酶造成限制性内切酶造成粘性末端粘性末端有利于重组有利于重组DNA DNA 分分子的构建子的构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理2 2、DNADNA连接酶的使用连接酶的使用vDNA连接酶连
9、接酶能够催化具有能够催化具有3-OH基团和基团和5-P基团的基团的DNA片段之间片段之间形成磷酸二酯形成磷酸二酯键。在基因克键。在基因克隆中用来连接隆中用来连接载体与目的基载体与目的基因。因。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理vDNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3-OH端,在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的端,在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩片段的体外合成与扩增技术的发展。增技术的发展。3 3、DNADN
10、A聚合酶的使用聚合酶的使用第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理4 4、逆转录酶的使用、逆转录酶的使用v逆转录酶可以逆转录酶可以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA,即,即cDNAcDNA(互互补补DNADNA)。)。在基因在基因克隆中常用来构克隆中常用来构建建cDNAcDNA文库。文库。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(四)基因克隆(四)基因克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理553333555 5 333 3 55+变性变性(94)复性复性(55)5 5 33P P1 13355+P2+P P1 1P2合成(合成(7272)PCR一般用一般用PC
11、R PCR 扩增扩增方法,根据已知方法,根据已知基因的序列设计基因的序列设计引物来克隆基因。引物来克隆基因。1、克隆已知基、克隆已知基因序列的基因因序列的基因第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理v在某种植物在某种植物的同源基因被的同源基因被克隆的条件下,克隆的条件下,可先构建可先构建cDNAcDNA 文库或基因组文库或基因组文库,然后以文库,然后以该基因(或部该基因(或部分序列)为探分序列)为探针来筛选目的针来筛选目的基因的克隆。基因的克隆。v作图克隆技术是随着分子标记作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克图谱的建立而发展
12、起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。克隆植物分因来克隆目的基因。克隆植物分子连锁图谱定位的基因,可采用子连锁图谱定位的基因,可采用作图克隆的策略。作图克隆是从作图克隆的策略。作图克隆是从连锁标记出发,通过大片段克隆连锁标记出发,通过大片段克隆(BACBAC或或YACYAC库)的染色体步移到库)的染色体步移到达靶基因。达靶基因。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理3 3、作图克隆、作图克隆v根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质,再
13、分离纯化这一蛋白并制备相应抗体;或测定其与该功能有关的蛋白质,再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体;或测定其氨基酸序列,推测可能的氨基酸序列,推测可能的mRNAmRNA序列,根据序列,根据mRNAmRNA序列设计相应的核苷酸探针序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库,也可进行或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库,也可进行PCRPCR扩增。扩增。2 2、功能克隆、功能克隆第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(1 1)消减杂交法)消减杂交法(2 2)DNA DNA 标签法标签法(3 3)差别显示技术)差别显示技术包括:包括:mRNA mRNA 差别显示法
14、等。差别显示法等。(4 4)缺陷互补和反义)缺陷互补和反义mRNAmRNA技术技术(5 5)cDNAcDNA微阵列和基因芯片技术微阵列和基因芯片技术4、表型差异克隆表型差异克隆v利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库,从中克利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库,从中克隆基因,如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质隆基因,如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。相互作用的蛋白质的编码基因。5、染色体大片段基因克隆、染色体大片段基因克隆第一节第一节 基因工程操
15、作原理基因工程操作原理第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理是将带有目的基因的外源是将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上,形成重组制并具有选择标记的载体分子上,形成重组DNA分子。分子。(五)体外重组(五)体外重组 理想的运载理想的运载体是质粒,当给体是质粒,当给它安装一段外来它安装一段外来 DNADNA片段后,它片段后,它依然如故地进行依然如故地进行自我复制。自我复制。(六)载体构建(六)载体构建第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理(1)农杆菌介导转化)农杆菌介导转化法:法:将外植体放入农杆将外植体放入农杆菌菌液中浸
16、泡,然后转菌菌液中浸泡,然后转入共培养基,再转入筛入共培养基,再转入筛选培养基诱导抗性愈伤选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽,生根后组织和抗性芽,生根后的抗性植株移栽至营养的抗性植株移栽至营养钵培养。钵培养。(七)转化(七)转化1、植物转基因技术、植物转基因技术第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理又称又称微弹轰击法微弹轰击法。其。其基本原理基本原理是将外源是将外源DNADNA包被包被在微小的金粒或钨粒表面,然后在高压的作用在微小的金粒或钨粒表面,然后在高压的作用下,微粒被高速射入受体细胞或组织,微粒上下,微粒被高速射入受体细胞或组织,微粒上的外源的外源DNADNA进入细胞后,整合到植物
17、染色体上,进入细胞后,整合到植物染色体上,得到表达,从而实现基因的转化,得到表达,从而实现基因的转化,(2)基因枪法)基因枪法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNADNA导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。(3)花粉管通道法)花粉管通道法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理8080年代初期周光宇年代初期周光宇转基因抗虫棉
18、转基因抗虫棉不依赖组织培养不依赖组织培养首先制备植首先制备植物原生质体,游物原生质体,游离出细胞,在倒离出细胞,在倒置显微镜和显微置显微镜和显微操作器的帮助下,操作器的帮助下,将目的基因将目的基因DNA通过微管注射到通过微管注射到受体细胞中。受体细胞中。(4)微注射法)微注射法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 在在短短时时间间的的高高压压直直流流电电脉脉冲冲的的冲冲击击下下,可可以以使使原原生生质质膜膜的的分分子子疏疏松松,形形成成暂暂时时性性的的直直径径为为3 34 4 nmnm的的小小孔孔,但但对对原原生生质质体体生生活活力力影影响响不不大大。这这时时,存存在在于于原原生生质
19、质体体周周围围溶溶液液中中的的外外源源DNADNA,就可以通过这种小孔进入原生质体,实现基因的直接转移。就可以通过这种小孔进入原生质体,实现基因的直接转移。(5)电穿孔法)电穿孔法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 原生质体在短时间的微束激光照射下,可在质膜表面形成面积原生质体在短时间的微束激光照射下,可在质膜表面形成面积约约0.25 m0.25 m2 2左右的小孔,使左右的小孔,使DNADNA分子进入细胞分子进入细胞。(6 6)微束激光打孔法)微束激光打孔法 世界上主要有世界上主要有4 4类已报道的方法:类已报道的方法:1 1)融融合合法法,包包括括精精子子融融介介法法,微微细细
20、胞胞介导融合等。介导融合等。2 2)化化学学法法,包包括括DNA-DNA-磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀法法、DEAE-DEAE-葡聚糖法、染色体介导法。葡聚糖法、染色体介导法。3 3)物物理理法法,包包括括显显微微注注射射法法、电电脉脉冲冲法、细胞冻存法等。法、细胞冻存法等。4 4)病病毒毒感感染染法法,包包括括重重组组DNADNA病病毒毒感感染染、重组重组RNARNA病毒感染等。病毒感染等。真正成熟方法真正成熟方法显微注射显微注射DNADNA法法精子介导法精子介导法核移植法核移植法2、转基因动物技术、转基因动物技术第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理核显微注射法核显微注射法是转基因技术中是
21、转基因技术中最常用的方法最常用的方法。它是在显微镜下将。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内,外源基因注射到受精卵细胞的原核内,注射的外源基因与胚胎基注射的外源基因与胚胎基因组融合,然后进行体外培养,最后移植到受体母畜子宫内发育,因组融合,然后进行体外培养,最后移植到受体母畜子宫内发育,这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA DNA 片段。片段。(1 1)核显微注射法)核显微注射法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理缺点:缺点:效率低效率低表达结果的不确定性表达结果的不确定性动物利用率低等动物利用率低等在反刍动物:繁殖周期长
22、,较强的时间限制、需要大量的受体动物。在反刍动物:繁殖周期长,较强的时间限制、需要大量的受体动物。精精子子介介导导的的基基因因转转移移是是把把精精子子作作适适当当处处理理后后,使使其其具具有有携携带带外外源源基基因因的的能能力力。然然后后,用用携携带带有有外外源源基基因因的精子给母畜授精。的精子给母畜授精。优优点点:成成本本很很低低,只只有有显显微注射法成本的微注射法成本的1 11010。由由于于它它不不涉涉及及对对动动物物进进行行手手术术处处理理,因因此此,可可以以用用生产牛群或羊群进行试验。生产牛群或羊群进行试验。(2 2)精子介导的基因转移)精子介导的基因转移第一节第一节 基因工程操作原
23、理基因工程操作原理先把外源基因与供体先把外源基因与供体细胞在培养基中培养,使细胞在培养基中培养,使外源基因整合到供体细胞外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞的细上,然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞胞核移植到受体细胞去去核卵母细胞,构成重建胚,核卵母细胞,构成重建胚,再把其移植到假孕母体,再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩,便可得待其妊娠、分娩,便可得到转基因的克隆动物。到转基因的克隆动物。(3 3)核移植转基因法)核移植转基因法第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理v遗传检测法遗传检测法v物理检测法物理检测法v菌落或噬菌斑杂交筛选法菌落或噬菌斑杂交筛选法v免疫化学检测法免疫化
24、学检测法vDNA蛋白质筛选法蛋白质筛选法v转译筛选法等转译筛选法等(八)重组体的筛选与鉴定(八)重组体的筛选与鉴定技术方法技术方法:第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理草甘磷是一种广谱除草剂,将含有抗草甘磷的草甘磷是一种广谱除草剂,将含有抗草甘磷的EP2SPEP2SP合合成酶突变基因引入植物,就可使植物获得抗除草剂特性,成酶突变基因引入植物,就可使植物获得抗除草剂特性,使大田作物便于除草,农业操作简便。使大田作物便于除草,农业操作简便。(九)培育新型品种(九)培育新型品种第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理在食品工业方面在食品工业方面可提高微生物菌种可提高微生物菌种性能,通
25、过基因工性能,通过基因工程改造的面包酵母程改造的面包酵母中麦芽糖透性酶和中麦芽糖透性酶和麦芽糖酶的含量比麦芽糖酶的含量比普通面包酵母高,普通面包酵母高,产生二氧化碳气体产生二氧化碳气体的量也较高,可制的量也较高,可制作出更松软可口的作出更松软可口的面包。面包。第一节第一节 基因工程操作原理基因工程操作原理 凝乳酶凝乳酶传统方法传统方法是从小牛胃中提取,是从小牛胃中提取,成本高,产量低,成本高,产量低,20 20 世纪世纪80 80 年代以年代以来,将凝乳酶原基来,将凝乳酶原基因导入大肠杆菌,因导入大肠杆菌,成功地进行了大规成功地进行了大规模的生产。模的生产。第一节第一节 基因工程操作原理基因工
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