《生化实验2电泳》PPT课件.ppt
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1、实验实验3 3血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳(Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins)遵义医学院生物化学教研室遵义医学院生物化学教研室 朱朱 欣欣 婷婷实验实验思路思路蛋白质的理化性质有哪些?蛋白质的理化性质有哪些?蛋白质的分离方法有哪些?蛋白质的分离方法有哪些?本次实验利用了哪个性质?本次实验利用了哪个性质?生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.掌握电泳法分离蛋白质的原理;掌握电泳法分离蛋白质的原理;2.2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
2、的原理和方法;和方法;3.3.进一步熟悉进一步熟悉721721型分光光度计的使用型分光光度计的使用 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤(分子筛)凝胶过滤(分子筛)亲和层析亲和层析 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷(一)电(一)电 泳泳 技技 术术 (electrophoresis)电泳电泳:带电粒子在电场的作用下向着与其电性带电粒子在电场的作用下向着与其电性
3、相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术析的技术。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷一、电泳的原理一、电泳的原理以蛋白质为例:以蛋白质为例:HOHHOHpHpI pH=pI pH 纤维状分子纤维状分子分子大小:分子大小:生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷Q Q越多,越多,u u越大;越大;分子小,分子小,r r越小,越小,u u越大;越大;2.2.缓冲溶液:缓冲溶液:pHpH值:值:(pH-pI)(pH-pI)越大,越大,Q Q越多,越多,u u越大越大离子强度离子强度(I)(I):
4、I I越大,电动电势越小,越大,电动电势越小,u u越小;越小;I I越小,电动电势越大,越小,电动电势越大,u u越大,越大,但样品易扩散。但样品易扩散。离子强度如果过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持离子强度如果过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pHpH恒定恒定 选择离子强度时要两者兼顾,一般离子强度的选择范选择离子强度时要两者兼顾,一般离子强度的选择范围在围在0.020.020.20.2之间。之间。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷电场强度:电泳支持物上每厘米的电位降,也称电势梯度。电场强度:电泳支持物上每厘米的电位降,也称电势梯度。3.3.电场强度电场强度(X)(X)X X越大,
5、越大,u u越快。越快。支持物越短,支持物越短,X X越大,越大,u u越快。越快。电场强度越大或支持物越短,电场强度越大或支持物越短,电流将随之增加,产热也电流将随之增加,产热也增加,影响分离效果。增加,影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置,否则可引起蛋在进行高压电泳的时候必须用冷却装置,否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。白质等样品发生热变性而无法分离。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷4.4.支持介质:支持介质:目前常用的电泳支持物:目前常用的电泳支持物:纤维薄膜纤维薄膜(玻璃纤维薄膜,醋酸纤维薄膜玻璃纤维薄膜,醋酸纤维薄膜)凝胶凝胶(琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝
6、胶琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶)生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷负极负极正极正极 表面带负电荷表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向带正电荷的水层携带粒子向负极移动负极移动 如果样品原本是移向负极的,则泳动的速度加快;如果样品原本是移向负极的,则泳动的速度加快;如果样品原本是如果样品原本是移向正极的,则泳动的速度减慢。移向正极的,则泳动的速度减慢。电渗作用电渗作用:电渗:电渗:在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷以纸电泳为例以纸电泳为例:(一)按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为:(一)按支持
7、物的物理性状不同,区带电泳可分为:1 1滤纸及其它纤维滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜维薄膜)电泳电泳2 2粉末电泳:如纤维素粉、淀粉电泳;粉末电泳:如纤维素粉、淀粉电泳;3 3凝胶电泳:如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶电泳:如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳;4 4丝线电泳:尼龙丝、人造丝电泳。丝线电泳:尼龙丝、人造丝电泳。三、区带电泳的分类三、区带电泳的分类 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷(二)按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:(二)按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:1 1平板式电泳:支持物水平放置;平
8、板式电泳:支持物水平放置;2 2垂直板式电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳;垂直板式电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳;3 3垂直柱式电泳:聚丙烯酰胺盘状电泳垂直柱式电泳:聚丙烯酰胺盘状电泳 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷(三三)按按pH pH 的连续性不同,区带电泳可分为:的连续性不同,区带电泳可分为:1 1连续连续pH pH 电泳:即整个电泳过程电泳:即整个电泳过程pH pH 保持不变,如常用保持不变,如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2 2非连续非连续pH pH 电泳:缓冲液和电泳支持物间有不同的电泳:缓冲液和电泳支持物间有不同的pH
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