细胞增殖实验.pdf
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1、细胞增殖检测方法细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类:DNA 合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和 ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择,主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。1.DNADNA 合成检测合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育,这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记,经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长,而且有个明显的弊端就,即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过,可以使用 5-溴-2-脱氧尿苷 BrdU 来进
2、行类似实验,因为 BrdU 也同样可以掺入到新合成的 DNA 中。但这样就需要进行额外的实验步骤,先孵育特异性BrdU 单抗和带标记的二抗,然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU 标记很适合免疫组化 IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内 ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。2.代谢活性检测代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加,因此其底物四唑盐或 Alamar Blue 在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少,形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来
3、读取含染料培养基的吸光度,从而衡量细胞的代谢活性,检测细胞增殖的情况。四种最常见的四唑盐是:MTT、XTT、MTS 和 WST1。MTT 在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲臜晶体需要溶解在 DMSO 或者异丙醇中。因此,MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与 Alamar Blue 一样,都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中 XTT 的效率较低,需要添加额外的因子;WST1 更灵敏有效,与其他盐相比能够更快显色;Alamar Blue 的灵敏度也很高,只要微孔板的孔中有 100 个细胞就能够检测到。四唑盐和 Alamar Blue 氧化还原染料能
4、够用于多种仪器和高通量研究,非常方便。它们适用的检测仪器包括:标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。3.活细胞数量活细胞数量最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时,所需细胞量较多,不推荐使用。4.增殖标志检测增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增殖细胞缺乏这些抗原,因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如,在人体细胞中,Ki-67 抗体识别同名蛋白,在细胞周期 S 期、G2 期和 M 期(增殖期)表达,而在 G0 期和 G1 期(非增殖期)不表达。用针对 Ki-67 蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析
5、。不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括:增殖细胞核抗原 PCNA、拓扑异构酶 IIB,以及磷酸化组蛋白 H3 等。5.ATPATP 检测检测细胞内的 ATP 含量受到了严格调控,检测 ATP 也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶 luciferase 及其底物荧光素 luciferin 的 ATP 检测以生物发光为基础,能够提供非常灵敏的结果。如果有ATP 存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与 AT
6、P 浓度成正比,用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。选择策略选择策略怎样选择最适合的检测方法,主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案,还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化,可以使用四唑盐和比色法检测;如果关注重点在于对DNA 合成的改变,可以选择用 BrdU 或 EdU 标记,再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析;若研究的是单个细胞,也可以用BrdU 或 EdU 标记来检测 DNA 合成,将其与荧光标记的相应抗体结合,就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。应该注意,测定细胞增殖很多时候单一
7、方法都是有缺陷的,四唑盐MTT法不够精确;最直接的指标是活细胞数量的变化,结果比较准确,但细胞直接计数法所需细胞量较多,操作繁琐费时;而3H 掺入法麻烦且不安全。所以,建议最好用两种以上的方法进行测定,这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。EdUEdU 实验流程实验流程一、实验原理一、实验原理EdU(5-Ethynyl-2-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞 DNA 复制活性,适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA 修复、病毒复制、细胞标记示踪
8、等方面的研究,尤其适合进行 siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。二、材料及准备工作二、材料及准备工作试剂、耗材名称Cell-Light EdU Apollo567In Vitro Imaging Kit(500T)细胞培养板或培养皿品牌广州锐博货号C10327-1试剂盒需试剂盒需 4C4C储存,荧光试剂请避光,勿冻存,可稳定储存一年储存,荧光试剂请避光,勿冻存,可稳定储存一年溶液配制溶液配制1.PBS(pH 7.27.6)PBS缓冲液10 xNaCl80 gKCl2 gNa2HPO412H2O36.151 g(Or Na2HPO414.4 gK2HPO42.4 g蒸馏水至
9、1000 mL调调 pHpH 值至值至 7.47.42.渗透剂(含 0.5%Triton X-100的 PBS)3.甘氨酸溶液(2 mg/mL)(去离子水配配制,现用现配去离子水配配制,现用现配)4.细胞固定液(即含 4%多聚甲醛的 PBS)多聚甲醛4 g1x PBS 定容至 100ml,磁力搅拌器加热搅拌,温度控制在温度控制在 6060以下以下。如仍不溶,滴加 NaOH(1N 或 0.1N),调 PH 值至 7.4。5.1%BSA 的 PBS6.甲醇7.无水乙醇三、操作步骤及注意事项三、操作步骤及注意事项A A 流式检测流式检测1.1.样本制备样本制备1.1 取对数生长期的细胞,105细胞接
10、种于 6 孔板或培养皿中,培养箱中培养过夜;1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。2.EdU2.EdU 标记标记2.1用细胞培养液以1:1000的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备适量50 M EdU培养基;2.2每孔加入 500 L 50M EdU培养基孵育 2h。(此步务必在超净台内完成此步务必在超净台内完成)3.3.细胞固定细胞固定3.1用 0.25胰酶进行消化,转至离心管,用 1PBS 吸打后,1000rpm5min,弃上清;3.2用含 1%BSA 的 PBS 吸打后,1000rpm5min,弃上清;3.34%多聚甲醛的 PBS 固定 15min,1000rpm5min,弃上清;3
11、.4用含 1%BSA 的 PBS 吸打后,1000rpm5min,弃上清;3.5300 L PBS吹散细胞,加入 700 L 无水乙醇(制成 70%乙醇 PBS 液),边加边震荡混匀,4固定 24h 以上;3.61000rpm5min,弃上清。4 4EdUEdU 反应反应4.1按下列顺序配置适量 1 Apollo反应液(现用现配,现用现配,3030 分钟用完,以免分钟用完,以免破坏正常的反应体系破坏正常的反应体系):4.2加入 500 L 的 1Apollo染色反应液,重悬细胞,避光室温孵育 30 min,1000rpm5 min;4.3加入 500 L 0.5%TritonX-100的 PB
12、S 吸打,1000rpm5min,重复 2 次;4.4每孔每次加入100 L 甲醇冲洗1次,每次5min;PBS 100L脱色摇床5min。5.5.染色染色5.1用去离子水按 100:1 稀释试剂 F,制备适量 1Hoechst33342 反应液,避光保存;5.2弃上清,加入 500 L 1 Hoechst 33342 反应液,避光室温孵育 30min,1000rpm5min;5.3 加入 500 L PBS吸打,1000rpm5min,重复2 次,洗脱Hoechst 33342 反应液。6 6流式分析流式分析6.1 1000rpm5min 收集细胞,300 L PBS吹散细胞,自备 300
13、目尼龙滤膜过滤(若吹打成单细胞悬液,可不过网若吹打成单细胞悬液,可不过网);转至流式管进行流式细胞仪分析,荧光通道依据实验仪器而设定。B B 荧光显微镜检测荧光显微镜检测1.1.样本制备样本制备1.1 取对数生长期的细胞,41031105细胞接种于96孔板中(细胞接种密度,细胞接种密度,没有严格要求,只要不影响显微镜下观察即可没有严格要求,只要不影响显微镜下观察即可),培养箱中培养过夜;1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。2.EdU2.EdU 标记细胞标记细胞2.1 用细胞培养液以 1:1000 的比例稀释 EdU 溶液(试剂 A),制备适量 50M EdU培养基;2.2 每孔加入 10
14、0 L 50M EdU 培养基孵育 2h。(此步务必在超净台内完成此步务必在超净台内完成);2.3 弃培养液,100 L PBS清洗细胞 2 次,脱色摇床上,每次 5min。3.3.细胞固定化细胞固定化3.1每孔加入 100 L 4%多聚甲醛的 PBS,室温脱色摇床孵育 30 min;3.22 mg/mL 甘氨酸脱色摇床孵育 5 min;(可在多聚甲醛固定时配置,现用可在多聚甲醛固定时配置,现用现配。目的:中和多聚甲醛现配。目的:中和多聚甲醛)3.3每孔加入 100 L PBS脱色摇床孵育每次 5 min;3.4每孔加入 100 L 0.5%TritonX-100的 PBS,脱色摇床孵育 10
15、 min;3.5每孔加入 100 L PBS脱色摇床孵育 1 次,10 min。4 4EdUEdU 反应反应4.1按下列顺序配置适量 1Apollo反应液(现用现配,现用现配,3030 分钟用完,以免分钟用完,以免破坏正常的反应体系破坏正常的反应体系):4.2每孔加入100 L的1Apollo染色反应液,避光,室温脱色摇床孵育30 min;4.3每孔每次加入 100 L 渗透剂(0.5%TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育 2次,每次 10min;4.4每孔每次加入100 L 甲醇冲洗1次,每次5min;PBS 100 L脱色摇床5min。5.5.染色染色5.1 用去离子水按 10
16、0:1 稀释试剂 F,制备适量 1Hoechst33342 反应液,避光保存;5.2 每孔加入 100 L 1Hoechst 33342 反应液,避光,室温脱色摇床孵育 30 min;5.3 每孔每次加入 100 L PBS脱色摇床孵育 2 次,每次 5min,洗脱 Hoechst 33342反应液。6 6图像获取及分析图像获取及分析6.1 建议染色完成后,立即进行观测,因易淬灭,曝光时间建议30ms;如果条件限制,请避光避光 4 4湿润保存待测,但不要超过湿润保存待测,但不要超过 3 3 天天。特别注意特别注意1、Apollo 染色反应液一定要现用现配,按顺序加样按顺序加样,小心称量试剂 E
17、,注意避注意避光光。试剂 E 易氧化,用毕请立即盖紧瓶盖。若发现试剂E 粉末变黄,极可能是发生了氧化失效。2、EdU 的使用浓度,用 50M 的较多,可以在 10-50M 间选择合适条件。3、EdU 荧光极易淬灭,请染色后立即送检或镜下观察。附:附:EdUEdU 与与 BrdUBrdU 实验步骤比较实验步骤比较EdU(5-Ethynyl-2-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速统计处于 S 期的细胞百分数来检测细胞 DNA 复制活性。适用于细胞增殖、细胞分化、生长
18、与发育、DNA 修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究,尤其适合进行 siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。1.EdU 的荧光染料是小分子物质(0.6103),相对于 BrdU 抗体这样的大分子物质(150103)来说能够轻松地透过膜结构,这种能够有效快速地扩散和穿透组织的能力使得大的组织和器官碎片标本的快速处理成为可能。2.这种小分子化学反应检测方法反应快,效率高,反应时间仅需几分钟,相比BrdU 检测需要抗原抗体过夜孵育,EdU 检测只需要 2.5 个小时。3.EdU 在检测掺入 DNA 分子中的乙炔基与小分子荧光叠氮化合物反应时不需要进行 DNA 变性处理(酸解、热
19、解、酶解等),有效保证了DNA 双链结构的完整性,避免样品损伤。不会像 BrdU 标记检测那样影响细胞核的复染,也不会破坏细胞的形态学特征以及细胞核抗原的识别位点。因此,EdU 检测技术就可以与包括细胞周期分析在内的其他 DNA 染色相结合,并且很好地相容。这种简单化的处理方式同样有助于在组织器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,使其具有更高的敏感度和更快的检测速度。4.EdU 标记可以通过结合其他抗体标记等技术,对细胞表面或细胞内特异性标志物进行多重检测和多参数分析,在细胞水平进行系统性定量检测,直接获取细胞多维信息,深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA 复制及修复、信号通路等方面
20、的研究。5.不同于 BrdU 标记检测技术那样依赖于抗原抗体的结合,EdU 检测中形成的这种特殊的生物合成物(稳定的三唑环)无需抗原抗体反应,有效地降低了背景的干扰,并显著提高了检测的灵敏度。6.BrdU 需要 DNA 变性后才能与抗体结合,导致BrdU、Hoechst 染色弥散,边缘模糊不清;而EdU 边缘清晰完整,检测更灵敏、更准确;Apollo 染料分子很小,能够轻松地透过膜结构,无需 DNA 变性即可与 EdU 特异结合发光,而且不会影响其与其它染料的结合,能够准确进行 DNA 定量。EU 是尿嘧啶的类似物,同样通过click化学反应能够标记上荧光。所不同的是 EU 是在细胞转录合成
21、RNA 的时候掺入到 RNA 里面。所以用这个技术能够染出目标细胞新合成的 RNA,从而达到检测细胞活性、毒性、RNA 转录定位、RNA 分布检测及 RNA 与蛋白的相互作用(此项需结合免疫荧光技术使用)等研究的目的,同样有高精度、高灵敏度、操作简单方便等诸多优点。EU 是研究细胞活性、毒性及 RNA 转录情况和机制等的理想工具。MTSMTS 检测细胞增殖实验检测细胞增殖实验一、一、实验原理实验原理本试剂盒是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethox
22、yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt;MTS(a)和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate;PES)。PES 具有增强的化学稳定性,这使它可与 MTS 混合形成稳定的溶液。MTS(Owens reagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物,可直接溶解于培养基中(图 1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的 NADPH 或 NADH 的作用下完成的。检测时,将少量的 CellTiter96 AQueous One Solution Reagent 直接加入培养板孔的培养基中,孵育 14 小
23、时,在 490nm 处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。二、二、材料及准备工作材料及准备工作试剂、耗材名称CellTiter 96AQueousOneSolution Cell Proliferation Assay96 孔细胞培养板品牌Promega货号G3581(5000T)特别注意特别注意1.2020C C 避光长期储存;频繁使用时避光长期储存;频繁使用时 44C C 避光保存避光保存 6 6 周周。注意:实验证明此试剂冻融 10 次后与新鲜的试剂使用效果相同;2.此物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚,因此建议在使用此试剂时带手套,穿实验服并带护目镜;3.CellT
24、iter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay是光敏感试剂,装在琥珀色的容器中。试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪色。这种褪色反应可能会导致 490nm 的背景吸光值轻微升高,但不会影响检测结果。实验准备实验准备1.多道加样器(排枪),或连续式加样器;2.酶标仪。三、操作步骤及注意事项三、操作步骤及注意事项1.1.样本制备样本制备1取对数生长期的细胞,以5103细胞接种于 96 孔板中作为增殖研究的起始细胞数。或根据实验细胞的增殖曲线选择合适的接种密度;由于最外缘培养孔中培养基的挥发较强,尽量避免在其中种入细胞,并且最由于最外缘培养
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