微生物实验精品资源共享.pptx
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1、微生物学实验微生物学实验实验流程土壤样品中微生物的 分离纯化细菌酵母菌霉菌放线菌形态结构观察生理生化反应nisin效价测定生长曲线测定形态观察死活细胞鉴定直接计数形态结构观察菌种保藏土壤样品中微生物的 分离纯化细菌土壤中微生物的分离、纯化土壤中微生物的分离、纯化和培养和培养相关理论知识(1)微生物的分离与纯化 从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。常用的分离、纯化方法 微生物能在固体培养基上长成菌落,通常一个菌株可以长成一个菌落。因此可通过挑取单菌落而获得一种微生物。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。相关理论知识(2)土壤生境 土壤是微生物生活的大本营
2、,土壤所含微生物无论在数量上,还是种类上都极其丰富,因此,土壤是获取微生物的重要来源,我们可以从土壤中分离、纯化得到许多有价值的微生物菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理。2、掌握常用的分离纯化微生物的方法。3、掌握倒平板的方法。4、进一步熟练和掌握微生物的无菌操作技术。5、掌握微生物的培养方法。实验原理微生物分离与纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。平板分离法 普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件(如营养成分、酸碱度、温度和氧等,或加入某种抑制剂),在平板上培养微生物,当
3、平板上长出单菌落后,挑取,得到纯种的微生物。试剂与器材1、材料 含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、根霉、青霉和放线菌的土壤样品,牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体)、马丁氏培养基、查氏培养基等2、试剂 培养基成分,水,琼脂3、器材 试管、三角瓶、涂布器、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿等。牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离细菌查氏培养基 NaNO3 2gK2HPO4 1gKCl 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g蔗糖 30g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离霉菌高氏一号培养基 可
4、溶淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂 15-20g用水定容至 1000ml用于分离放线菌马丁氏培养基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g K2HPO4 1g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 15-20g pH 自然 用水定容至 800ml 用于分离酵母菌实验步骤注意事项1、实验过程中关闭紫外灯2、本实验要严格地按照无菌操作进行。3、接种环要灼烧灭菌。接触菌体前要冷却。接种后要在火焰上灼烧。4、实验在洁净工作台内进行,操作时菌体不 应和火焰太过接近。5、培养时要倒置培养,防止染菌。6、取单菌落时不要碰到其
5、它的菌落。细菌的形态结构观察细菌的形态结构观察相关理论知识细菌形态群体的形态 细菌菌落大多表面光滑湿润,有光泽,一般菌落较小,质地颜色均匀,同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。个体的形态 主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。细菌形态随培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌个体微小,较透明,必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求,可将染色分为简单染色、鉴别染色、特殊染色三种类型。目的要求1、了解简单染色法的原理,并掌握其操作方法2、初步认识细菌的形态。3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌 操作技术
6、。4、巩固显微镜的油镜的使用方法。简单染色法原理 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常带负电荷,碱性染料(解离时分子的染色部分带正电荷)如美兰、结晶紫等易与细菌结合使其着色。试剂与器材1、材料 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌2、试剂 吕氏碱性美蓝染液或草酸铵结晶紫染液3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶(内 装香柏油及二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。实验步骤涂片干燥:室温自然干燥固定:通过火焰23次,细胞质凝固染色:滴加染液冲洗:水洗至无色干燥:自然干燥镜检注意事项涂片时水滴不要太大,菌体最好涂成一个薄膜。要求涂布均匀。室温自然干燥。固定时,通过火焰2
7、3次,不可以加热过久。染色时,滴加染液覆盖上菌体薄膜即可。冲洗时,水洗至无色,要注意水流要有一个角度,从载片的一端自然流到另一端,但是水流要通过染色过的菌体薄膜。水流不宜过大,防止将菌体冲走。镜检时,油镜与普通的物镜要严格地按照操作规程执行。细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色相关理论知识革兰氏染色法 它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师Gram创立。菌种鉴定的重要手段 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类,它是细菌学上最常用的鉴别染色法。目的要求1、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法 步骤。2、掌握革兰氏染色法的原理。革兰氏染色实
8、验原理 革兰氏染色能将细菌分为G+菌和G-菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后变成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。试剂与器材1、材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。2、试剂 结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶(内 装香柏油及二甲苯)、擦镜纸
9、、生理盐水等。革兰氏染色实验步骤制片:取菌种培养液常规涂片,干燥,固定。初染:滴加结晶紫,染色12min,水洗;媒染:用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗;乙醇脱色:滤纸吸去残水,倾斜玻片用95乙醇 洗涤脱色至无色,立即水洗;复染:番红液复染约2min,水洗;镜检:革兰氏阳性菌(蓝紫色);革兰氏阴性菌 (红色)实验结果(1)革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌革兰氏染色结果革兰氏染色结果 注意事项1.涂片务求均匀,切忌过厚。2在染色过程中,不可使染液干涸。火焰固定不 宜过热。3脱色时间十分重要,过长,则脱色过度,会使阳 性菌被染成阴性菌;脱色不够,则会使阴性菌被 染成阳性菌
10、。4不能选用老龄菌。细菌细胞的生理生化反应细菌细胞的生理生化反应相关理论知识(1)微生物分类学它是一门按微生物的等级关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群(taxon)的科学。它具体的任务是分类(classification)、鉴定(identification)和命名(nomenclature)。相关理论知识(2)微生物的鉴定获得该微生物的纯种培养物(pureculture);测定一系列必要的鉴定指标;查找权威性的鉴定手册。经典分类鉴定方法 形态;生理、生化反应;生态特性;生活史特点;血清学反应(免疫学鉴定);噬菌体的敏感性等现代分类鉴定方法 微生物遗传型的鉴定 细胞化学成分的鉴定
11、目的要求1、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验 原理和方法。2、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物 在鉴别细菌中的意义。3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。实验原理(1)各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同,所能发酵的类型和最终产物也不一样。微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过水解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。
12、实验原理(2)有些细菌代谢过程中产酸(乳酸、醋酸、丙酸)和/或产气(H2,CH4,CO2);酸用指示剂检测;气通过直接观察。有些细菌含有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色,不能直接看见,但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时,该试剂与吲哚作用,形成红色的玫瑰吲哚。有些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中的氧气氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称VP反应。实验原理(3)某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的pH降至4.5以下,
13、当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醚、气体和水等),则培养基的酸度仍在pH6.2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性。实验原理(4)不同细菌利用柠檬酸盐能力不同,有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源,有的则不能。某些细菌将柠檬酸盐分解为二氧化碳,培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠,使培养基碱性增加。根据培养基中指示剂变色来判断实验结果。指示剂可用溴麝香草酚蓝(pH6 呈黄色,pH 6-7.6呈绿色,pH7.6呈蓝色)。有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢,硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐,可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀,从
14、而可确定硫化氢的产生。多糖的水解吲哚实验 1吲哚实验 2伏普实验试剂与器材1、材料 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、固体淀粉培养基。2、试剂 甲基红试剂、40%氢氧化钾、5%-萘酚、乙醚、吲哚试剂。3、器材 德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱、高压灭菌器等。淀粉的水解实验1、固体淀粉培养基灭菌后冷却至50,倒平板;2、用记号笔将平板分区,不同的区域接种不同的菌种,记录接种的菌种名;3、平板倒置在37培养24h;4、将平板打开,加入Lugols碘液,轻轻旋转,观察结果。糖发酵实验实验步骤 取半固体葡萄糖发酵培养基试管2支,分别用接种针穿刺接入大肠杆菌
15、、枯草芽孢杆菌,37 培养24h。观察记录 与对照管比较,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该种糖,记录用“”表示;如培养液呈黄色,反应结果为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸,记录用“”表示。培养液中有气泡为阳性反应,表明该菌分解糖能产酸并产气,记录用“”表示;如管内没有气泡为阴性反应,记录用“”表示。吲哚实验实验步骤 用接种环分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌到含有蛋白胨水培养基的2支试管中,将试管置37恒温培养箱中培养48h。向培养后的蛋白胨水培养基内加3-4滴乙醚,摇动数次,静置3min,待乙醚上升后,沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂。观察记录 在乙醚与培养物之间产生红色
16、环状物的,为阳性反应,否则为阴性。V-P test 以无菌操作分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基(V-P test),置37恒温箱中培养。向培养物内加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5%-奈酚溶液,用力振荡,再放入37 保温15-30 min,若培养物呈红色,为V-P test 阳性。甲基红实验 分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基,置37恒温箱中培养。向培养物内加入甲基红指示剂1至2滴,阳性呈鲜红色,阴性为黄色。柠檬酸盐利用实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于2支柠檬酸盐斜面上,置于37培养24-48小时。观察柠檬酸盐培养基上有
17、无细菌生长和是否变色,斜面呈蓝色的是阳性反应,呈绿色的为阴性反应。硫化氢产生实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别穿刺接种于2支半固体培养基中,置于37培养24-48小时。观察结果,如培养基中出现黑色沉淀线者,为阳性反应。注意事项1、实验中无菌操作。2、吲哚实验中加入乙醚时要缓慢地加入。3、培养时间达到要求时间,现象明显。4、配制氢氧化钾时,要注意不要腐蚀皮肤和实验台。酵母菌的形态观察、直接计数及酵母菌的形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定死活细胞的鉴定相关理论知识酵母菌形态 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多。酵
18、母菌无鞭毛,不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等,有的还具有微体。单细胞的酵母菌单细胞的酵母菌 面包酵母(长有芽孢)面包酵母(长有芽孢)酵母菌的出芽生殖酵母菌的出芽生殖 真菌菌丝和酵母菌真菌菌丝和酵母菌相关理论知识酵母菌菌落特征 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似,但比细菌菌落大而厚,菌落表面光滑、湿润、粘稠,容易挑起,菌落质地均匀,正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一,菌落多为乳白色,少数为红色,个别为黑色。啤酒酵母的菌落啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落红酵母的菌落 各种酵母菌的菌落各种酵母菌的菌落 显微计数法 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的
19、悬浮液。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫霍泽细菌计数板计数。两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜。血球计数板 血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区,计数区的刻度有两种:一种是计数区分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格,而每个中方格又分成16个小方格。不管计数区是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成。血球计数板特征目的要求1、观
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