达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌D-30原生质体制备及再生,微生物论文.docx
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1、达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌D-30原生质体制备及再生,微生物论文达托霉素(daptomycin)是玫瑰孢链霉菌(Strep-tomycesroseosporus)发酵产物脂肽类化合物A21978C的N-癸酰基衍生物,是环酯肽类新抗生素家族的第1个产品。 1987年Lilly公司首先发现达托霉素具有良好的抗菌活性,1997年Cubist公司获得该药的开发权,2003年美国食品与药物管理局(FDA)批准注射用达托霉素上市。 达托霉素具有独特的化学构造,含有13个氨基酸,华而不实10个氨基酸构成环十脂肽,另外3个氨基酸肽链N-末端的色氨酸与1个癸酸侧链相连。达托霉素的作用机制不同于其它抗生素,既能够
2、扰乱细胞膜转运氨基酸,使细菌无法合成细胞壁的主要成分肽聚糖,可以以毁坏细胞膜进而杀死细菌。达托霉素能杀死绝大多数的革兰氏阳性菌,十分是对耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌等有很强的活性,被以为是 病原菌最后一道防线 万古霉素 的最佳替代品。 原生质体由于去除了外壁障碍,因此对各种诱变剂敏感性较强,往往正突变率高,近年来原生质体诱变育种技术被广泛应用。王晓蕾等通过紫外诱变筑波链霉菌原生质体,挑选得到1株高产菌株,与出发菌株相比,该菌株的他克莫司平均发酵单位提高51.4%。朱林东等通过紫外诱变始旋链霉菌11-2原生质体,获得高产突变株ZP-07,普那霉素产量比出发菌株提高101.3
3、%。而当前原生质体诱变选育达托霉素高产菌株尚未见报道。作者研究了达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌D-30原生质体制备及再生的最适条件,并采用紫外诱变方式方法处理制备的原生质体,以期挑选得到达托霉素的高产菌株。 1、实验 1.1菌种 玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)D-30,华北制药集团研发中心保存。 1.2培养基 分离培养基(g L-1):葡萄糖20,酵母粉20,MgSO4 7H2O1.5,K2HPO41,NaCl0.5,琼脂15,pH值7.5。种子培养基(g L-1):葡萄糖5,糊精15,蛋白胨10,酵母粉10,MgSO4 7H2O0.3,K2HPO40.2,甘氨酸适
4、量,pH值7.5。发酵培养基(g L-1):葡萄糖7,可溶性淀粉15,酵母粉5,蛋白胨15,K2SO48,L-天冬氨酸0.5,pH值7.0。微量元素、TES缓冲溶液、P液、再生培养基的配制参照(工业微生物实验技术手册。 1.3原生质体的制备 在含有甘氨酸的种子培养基中接种新鲜玫瑰孢链霉菌D-30的斜面孢子,摇瓶培养温度28、摇床转速220r min-1,培养一段时间后以3000r min-1离心收集菌丝体,用含有玻璃珠的三角瓶打碎、用P液以3000r min-1离心洗涤3次,参加一定浓度的溶菌酶溶液,涡旋混匀,在水浴温度32下进行酶解,每隔5min摇摆1次,当原生质体构成数量较多时停止,先以6
5、00r min-1低速离心10min,取上清,去除混合液中的细胞壁和菌丝片断,再用P液以3000r min-1离心洗涤3次,将得到的原生质体转移到P液中备用。 1.4原生质体的再生 将分离培养基和再生培养基灭菌后倒入无菌平皿中,待培养基凝固后打开平皿盖,在超净台上风干外表的水分。用酶解前的菌丝体涂布含有分离培养基的平板;用P液将原生质体稀释到一定浓度后涂布含有再生培养基的平板、用无菌水将原生质体稀释到一定浓度后涂布含有再生培养基的平板,将3种平板28恒温培养9d。 1.5原生质体的制备率、再生率计算 原生质体的制备率、再生率按以下公式计算: 式中:A为用酶解前的菌丝体涂布分离培养基平板长出的菌
6、落数;B为用P液将原生质体稀释到一定浓度后涂布再生培养基平板存活的菌落数;C为用无菌水将原生质体稀释到一定浓度后涂布再生培养基平板存活的菌落数。 1.6原生质体紫外诱变 用P液将原生质体稀释到适当浓度后用吸管将其转到无菌平皿中,每皿100 L,轻轻晃动待其混匀后放置在30W紫外灯下32cm处,进行不同照射时间诱变处理:0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s;照射后于暗处静置30min,收集诱变后的原生质体,将其稀释到一定浓度后涂布在含有再生培养基的平板上。 1.7发酵培养 挑选再生培养基平板上培养成熟的单菌落接种至空白斜面,于28恒温培养9d,待培养好后接种于种子培养基,
7、摇瓶温度28、摇床转速220r min-1,培养30h。汲取0.5mL培养好的种子液接种于发酵培养基,摇瓶温度28、摇床转速220r min-1,培养120144h后取发酵液测效价。 1.8分析方式方法 采用HPLC法测定发酵液中达托霉素的产量。液相色谱条件:反向C18色谱柱;流动相为含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(4654,体积比);流速1mL min-1;检测波长220nm;柱温32;进样量15 L。 2、结果与讨论 2.1种龄对原生质体构成的影响 不同种龄的菌丝经过处理后都能够制成原生质体,但原生质体制备率差异较大。一般对数生长期的菌丝利于原生质体的制备,原生质体的再生效果也比拟好。分别采
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