Cre-loxp基因敲除PPT参考幻灯片课件.ppt
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1、01Cre-LoxP重组酶系统12023/2/191.Cre重组酶重组酶1981年从P1噬菌体中发现,Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp,编码由 343 个氨基酸组成的38kDa单体蛋白。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的 DNA 序列,即 loxP 位点,使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率,不借助任何辅助因子,可作用于多种结构的 DNA 底物,如线形、环状甚至超螺旋 DNA。它是一种位点特异性重组酶,能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组,使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。22023/2/192.LoxPLoxP序列
2、序列是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成,8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合,13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下:5-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3 3-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-532023/2/193.Cre重重组组酶酶介介导导两个两个LoxP位点位点间间的重的重组组过程过程如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,且方向相同,Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列;如果两个LoxP位点位于一条D
3、NA链上,但方向相反,Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。42023/2/19如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。52023/2/194.Cre-loxP系统的特点系统的特点loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
4、Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;62023/2/19传统基因敲除技术的缺点knockout 小鼠的所有细胞基因组上都存在基因的缺失突变,往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡,不利于在发育后期阶段基因功能的分析。即使发育完整的突变体小鼠,对于 knockout 表型的解释常遇到两个困难问题:一是所有体细胞基因的剔除,很难将异常的表型归于哪一类细胞或组织;二是很难排除在成熟动物上由于发育缺陷所引起的异常表型。新霉素抗性基因(neo)和单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)为正负
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