液质联用实用.pptx
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1、液质联用液质联用(HPLC/MS/MS)(HPLC/MS/MS)仪器构造仪器构造HPLC/MS/MSHPLC/MS/MS分析测试原理及功能分析测试原理及功能仪器适用范围仪器适用范围测试条件的选择测试条件的选择谱图分析谱图分析第1页/共76页HPLC/MS/MSHPLC/MS/MS示意图示意图(*)(*)自动进样器 色谱柱 PDA(阵列二极管检测器)离子化室 质量分析器检测器液相色谱 质谱计算机第2页/共76页液质联用仪器结构质谱质谱离子化室离子化室第3页/共76页液质联用仪器结构四元泵四元泵(包括包括真空脱气机真空脱气机)柱温箱柱温箱PDA检测器检测器溶剂瓶箱溶剂瓶箱自动自动进样器进样器第4页
2、/共76页液相色谱流程图液相色谱流程图PUMPDetectorWData station(Recorder)or Collection高效液相系统高效液相系统第5页/共76页高效液相系统高效液相系统储液罐储液罐过滤与脱气装置过滤与脱气装置高压输液泵高压输液泵梯度洗脱装置梯度洗脱装置进样系统进样系统第6页/共76页1)1)过滤与脱气装置过滤与脱气装置(*)洗脱液进入高压泵前应充分脱气,不脱气的影响:洗脱液进入高压泵前应充分脱气,不脱气的影响:气泡留在泵中影响泵的正常工作,使洗脱液压力不气泡留在泵中影响泵的正常工作,使洗脱液压力不稳定,增加基线的噪声;稳定,增加基线的噪声;洗脱液中溶解的氧能破坏样
3、品,同时氧在洗脱液中溶解的氧能破坏样品,同时氧在190190230nm230nm有弱的吸收,从而减小检测有弱的吸收,从而减小检测器的灵敏度;器的灵敏度;当洗脱液流出色谱柱进入检测器样品池时由于洗脱压力下降生成气泡影响检测器的正常工作。当洗脱液流出色谱柱进入检测器样品池时由于洗脱压力下降生成气泡影响检测器的正常工作。第7页/共76页常用的脱气方式常用的脱气方式:低压脱气法;低压脱气法;吹氦脱气法;吹氦脱气法;超声波脱气法;超声波脱气法;在线脱气。在线脱气。第8页/共76页在线脱气流动相流经小真空包中的半透膜管路,其中的气体透过半透膜,由真空泵抽流动相流经小真空包中的半透膜管路,其中的气体透过半透
4、膜,由真空泵抽走,从而达到脱去流动相中溶解空气的目的。走,从而达到脱去流动相中溶解空气的目的。第9页/共76页2)2)梯度洗脱装置梯度洗脱装置 当一个样品的混和物的容量因子当一个样品的混和物的容量因子k k范围很宽,等度冲洗时,一则时间太长,二则后面的峰较宽或扁平不便范围很宽,等度冲洗时,一则时间太长,二则后面的峰较宽或扁平不便检测,此时选用梯度洗脱冲洗可改善样品的分离度,检测,此时选用梯度洗脱冲洗可改善样品的分离度,缩短分析时间,改善峰形和提高样品的最小检测量。缩短分析时间,改善峰形和提高样品的最小检测量。第10页/共76页a a 高压梯度洗脱高压梯度洗脱 将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度装
5、置。将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度装置。洗脱流量精度高,重复性好,不易产生气泡。洗脱流量精度高,重复性好,不易产生气泡。混合器混合器B泵泵A泵泵梯度程序控制梯度程序控制第11页/共76页b b 低压梯度洗脱装置低压梯度洗脱装置 在常压下,按预先设定的比例混合,再由在常压下,按预先设定的比例混合,再由高压泵输入色谱柱。重现性好,精度高,仪器高压泵输入色谱柱。重现性好,精度高,仪器组合简单,但混和前必须高度脱气。组合简单,但混和前必须高度脱气。混合器混合器高压输液高压输液四通四通第12页/共76页 分离方法分离方法液固色谱法(液固色谱法(liquid-solid liquid-solid chr
6、omatographychromatography)反相和正相色谱法反相和正相色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子交换色谱离子交换色谱离子色谱法离子色谱法空间排斥色谱空间排斥色谱亲和色谱法亲和色谱法胶束色谱法胶束色谱法手性色谱法等手性色谱法等第13页/共76页HPLCHPLC分离原理分离原理最广的色谱法是最广的色谱法是反相色谱反相色谱主要用于分离主要用于分离非极性至中等极性非极性至中等极性的各类分子型化合物,因为键的各类分子型化合物,因为键合相表面的官能团不流失,溶剂的极性可以在很大范围内调整,合相表面的官能团不流失,溶剂的极性可以在很大范围内调整,因此应用范围很宽。因此应用范围很宽。十八烷基(
7、十八烷基(C18C18)化学键合相)化学键合相是最常用的非极性键合相,反相键是最常用的非极性键合相,反相键合相表面具有非极性烷基官能团,及未被取代的硅醇基。硅醇合相表面具有非极性烷基官能团,及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能,剩余硅醇基的多寡,视覆盖率而定。因此,基具有吸附性能,剩余硅醇基的多寡,视覆盖率而定。因此,分离机制比较复杂。分离机制比较复杂。第14页/共76页反相色谱分离原理反相色谱分离原理疏溶剂理论:当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与疏溶剂理论:当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时,相互产生斥力,自由能(极性溶剂相接触时,相互产生斥力,自由能(G
8、G)增加,熵减小,)增加,熵减小,不稳定性增加。根据热力学第二定律,系统不稳定到稳定是自不稳定性增加。根据热力学第二定律,系统不稳定到稳定是自发的。因此,为了弥补熵的损失,溶质分子中的非极性基的取发的。因此,为了弥补熵的损失,溶质分子中的非极性基的取向,将导致在溶剂中形成一个向,将导致在溶剂中形成一个“空腔空腔”,这种效应称为疏溶剂,这种效应称为疏溶剂或疏水效应。该理论认为,在键合相反相色谱法中溶质的保留或疏水效应。该理论认为,在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力,而是溶质分子与主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力,而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力,促使溶
9、质分子与键合相的烃基发生极性溶剂分子间的排斥力,促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。疏水缔合。第15页/共76页反相色谱的流动相反相色谱的流动相反相色谱法的反相色谱法的流动相的极性大于固定相流动相的极性大于固定相,通常是用,通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与等极性溶剂与底剂水底剂水组成二元或组成二元或多元流动相。多元流动相。在反相色谱中,由于固定相是非极性的,所以溶剂的在反相色谱中,由于固定相是非极性的,所以溶剂的极性增加,极性增加,分离结构相近的组分时,分离结构相近的组分时,极性大的组分先极性大的组分先出柱出柱。第16页/共76页液相色谱的检测方法液相色谱的检测
10、方法紫外可见光检测器紫外可见光检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器化学发光检测器化学发光检测器红外光谱检测器等红外光谱检测器等第17页/共76页离子化的方法离子化的方法(Ionisation Methods)Ionisation Methods)电子轰击电离电子轰击电离 EIEI化学离子化化学离子化 CICI场电离,场解吸场电离,场解吸 FDFD快原子轰击快原子轰击 FABFAB基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离 MALDIMALDI电喷雾电离电喷雾电离 ESIESI大气压化学电离大气压化学电离 APCIAPCI第18页/共76页电喷
11、雾电离源电喷雾电离源Electrospray Ionization(ESI)Electrospray Ionization(ESI)第19页/共76页在强电场下溶液带电 形成带电液滴带电液滴体积不断缩小(溶剂蒸发,不断发生库仑爆炸)离子逸出表面,蒸发进入空间电喷雾电离的实质:电荷浓缩效应电喷雾电离的实质:电荷浓缩效应电喷雾电离的实质:电荷浓缩效应电喷雾电离的实质:电荷浓缩效应电喷雾电离电喷雾电离第20页/共76页电喷雾电离电喷雾电离(ESI)*(ESI)*+_+_+蒸发蒸发 带电液滴带电液滴小液滴小液滴 ESIESI离子蒸发机理离子蒸发机理第21页/共76页第22页/共76页大气压化学电离源大
12、气压化学电离源 Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)APCI APCI 离子化过程离子化过程1.1.高电压放电针与载气和溶剂反应产生初级的离子高电压放电针与载气和溶剂反应产生初级的离子 O O2 2+e O+e O2 2+2e+2e N N2 2+e N+e N2 2
13、+2e+2e2.2.通过一系列复杂的反应初级离子与溶剂分子反应生通过一系列复杂的反应初级离子与溶剂分子反应生 成溶剂离子成溶剂离子 H H3 3O O+and CH and CH3 3OHOH2 2+3.3.溶剂离子与待分析物分子形成溶剂离子与待分析物分子形成(M+H)(M+H)或者或者 (M-H)(M-H)-H H3 3O O+M (M+H)+M (M+H)+H+H2 2O O OH OH+M (M-H)+M (M-H)-+H+H2 2O O *比较比较ESI EI APCIESI EI APCI电离源电离源第23页/共76页第24页/共76页大气压化学电离源大气压化学电离源第25页/共76
14、页*ESI*ESI和和APCIAPCI的异同的异同离子产生的方式离子产生的方式1.APCI1.APCI利用电晕放电离子化,气相离子化。利用电晕放电离子化,气相离子化。2.ESI2.ESI利用液相离子化,带电液滴溶剂蒸发形成离子。利用液相离子化,带电液滴溶剂蒸发形成离子。能被分析的化合物类型不同能被分析的化合物类型不同1.APCI 1.APCI 弱极性,小分子化合物,且具有一定的挥发性弱极性,小分子化合物,且具有一定的挥发性2.ESI 2.ESI 极性化合物和生物大分子。极性化合物和生物大分子。第26页/共76页ESIESI和和APCIAPCI的异同的异同流速流速1.ESI 0.0011.ESI
15、 0.001到到0.25 ml/min0.25 ml/min。2.APCI 0.22.APCI 0.2到到2 ml/min2 ml/min。多电荷多电荷1.APCI1.APCI不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析大分子。不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析大分子。2.ESI 2.ESI 能生成一系列多电荷离子,特别适用于蛋白,多肽类等能生成一系列多电荷离子,特别适用于蛋白,多肽类等生物分子。生物分子。都属于软电离方式,能够提供分子量的信息都属于软电离方式,能够提供分子量的信息第27页/共76页EI离子源质谱图离子源质谱图第28页/共76页ESI离子源质谱图M+Na+M+K+M+H+MW
16、=582第29页/共76页离子源的选择离子源的选择第30页/共76页质量分析器质量分析器将离子源产生的离子按其质量和电荷比(将离子源产生的离子按其质量和电荷比(m/zm/z)的不同进行分离,得到按质荷)的不同进行分离,得到按质荷比(比(m/zm/z)排列而成的质谱图)排列而成的质谱图质量分析器的种类很多:有磁质量分析器,质量分析器的种类很多:有磁质量分析器,四级质量分析器(四级杆滤质器四级质量分析器(四级杆滤质器),飞行时间质量分析器,离子阱质量分析器等,飞行时间质量分析器,离子阱质量分析器等三重四极杆三重四极杆(串联质谱)(串联质谱)第31页/共76页TSQ 质谱组件质谱组件QOO QOQ1
17、HyperquadQ3HyperquadQ2Collision CellDetectionSystemIon SourceInterfaceHeatedCapillaryMass Analyzer第32页/共76页Q1Q3Q2Q0DynodeTurbo第33页/共76页仪器主要功能仪器主要功能定性分析(混合物)样品中的物质:分子量、分子结构、相对含量定性分析(混合物)样品中的物质:分子量、分子结构、相对含量定量分析样品中的物质含量定量分析样品中的物质含量精密质量数的测定精密质量数的测定第34页/共76页高分辨质谱进行元素组成分析高分辨质谱进行元素组成分析 任何一种同位素的任何一种同位素的质量并
18、不是正好的整数质量并不是正好的整数。为了区分这四个离子,测量的质量的准确度需达为了区分这四个离子,测量的质量的准确度需达到到130 ppm。即小数点后。即小数点后第四位是准确的第四位是准确的。元素组成信息随着质量的增加而呈指数地上升,元素组成信息随着质量的增加而呈指数地上升,对质谱质量的测定准确度要求更高。对质谱质量的测定准确度要求更高。12C=12.00000000,1H =1.007782506,14N=14.00307407,16O=15.99491475 m=43.0184Da的离子的离子必定是必定是C2H3O+,不可能是不可能是C3H7+(m=43.0058)或或 C2H5N+(m=
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