动物寄生虫病PCR诊断技术.pdf
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1、 动物寄生虫病 PCR 诊断技术 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是一种既敏感又特异的 DNA 体外扩增方法,它可将一小段目的 DNA 扩增上百万倍,其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物,此法只扩增出种、株特异的 PCR 产物,具有很高的特异性。而且 PCR技术的操作过程也相对简便快捷,无需对病原进行分离纯化;同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰,直接检测到病原体的 DNA,既可用于虫种、株的鉴别,动物寄生虫病的临床诊断,又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着 PCR 技术的不断完善与发展,它
2、已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域,具有广泛的应用前景。一、实验目的要求 掌握 PCR 诊断技术所涉及实验的基本原理,全面熟悉 PCR 诊断技术的操作过程,其中包括寄生虫 DNA的提取、PCR 引物的设计、PCR 条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR 产物的纯化等等。二、实验仪器和材料(一)寄生虫基因组 DNA 的提取及纯化 1.虫体材料。单个虫体。2.器具。超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G 高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。3.试剂。(1)乙二胺四乙
3、酸(Ethylene diaminetetra acetic acid,EDTA)、十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tri(Hydroxymethyl)Aminomethane-HCl,Tris-HCl)、氯化钠、蛋白酶K(25g/l)、异丙醇(80%)、双蒸水、灭菌超纯水等。(2)DNA 裂解液:500 mM NaCl 70 l、100 mM Tris-HCl(pH 8.0)30 l、50 mM EDTA(pH 8.0)150 l、10%SDS 30 l。(3)WizardTM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的 DN
4、A 提取试剂盒。(二)PCR 扩增及琼脂糖电泳 1材料。提纯的虫体 DNA。2器具。超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器(2/20/200/1000 l)、PCR 扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管(200/500/1500 l)、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒(100 ml)、三角瓶(500 ml)等。3试剂。(1)10PCR Buffer(无 Mg2+)、dNTP(2.5 mM each)、ddH2O、MgCl2(25 mM)、Primers、Ex Taq酶(5 U/l)、琼脂糖、EB(10mg/ml)、Tris 碱、硼酸(Bor
5、ic acid)、去离子水、EDTA(0.5 mol/L,pH 8.0)、10载样缓冲液。(2)0.5TBE 缓冲液:准确秤取 Tris 碱 5.4g,硼酸 2.75g,充分溶解于 800 ml 去离子水中,加 10ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0),用去离子水定容至 1000ml。(三)PCR 扩增产物的纯化 1材料。PCR 扩增产物。2器具。TGL-16G 高速台式离心机;三用电热恒温水箱;微量取液器(2/20/200/1000 l)、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管(500/1500 l)、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒(100
6、ml)、三角瓶(500ml)、手术刀、保鲜纸等。3试剂。琼脂糖;0.5TBE 缓冲液;UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒;UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化试剂盒;异丙醇(80%)等。三、实验方法、步骤和操作要领(一)寄生虫基因组 DNA 的提取及纯化 1.实验原理。应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组 DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组 DNA 的抽提材料,如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部,以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小(小于 1 cm),则应使用整条虫体抽取 DNA。若虫体特别细小(例如幼虫),可用多条虫体来提取 DNA。为了获
7、得高含量、高纯度的 DNA,最好使用新鲜材料。从冻干或 50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取 DNA。寄生虫 DNA 的抽提方法有多种,不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法,但各种方法的基本原理都一样,即先用机械的方法将虫体组织破碎,然后加入 DNA 裂解液和蛋白酶 K,充分作用后,虫体组织中的细胞膜破裂,蛋白质变性,将虫体基因组 DNA 释放到溶液中。在裂解过程中,虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物,后者被 DNA 裂解液中的 SDS 包盖,通过离心沉淀,这些复合物会从溶液中沉淀下来,变性剂也同时被除去,从而就可从上清中回收虫体基因组 DNA 溶液。回收后
8、的虫体基因组DNA 液用 WizardTM DNA 纯化试剂盒进行纯化。纯化时,DNA 溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后,其混合液在通过微型柱时 DNA 会结合在柱上,而其它杂质会通过微型柱排出;再用 80%异丙醇进行冲洗,去除残余杂质。最后,在微型柱中加入预热的 TE 缓冲液或超纯水,使结合在微型柱上的 DNA 充分溶解,通过离心,其洗脱液即为纯化的虫体基因组 DNA 溶液。2实验方法、步骤和操作要领。(1)虫体材料的处理(若为新鲜或冻干保存的虫体,则不需要此步骤)。若虫体较大,用镊子将保存在 70%的酒精溶液中的虫体材料取出,剪取其中部,保存其头端或尾端部分。用双蒸水反复吹打冲洗 2 次
9、后,再用超纯水反复冲洗 23 次,置于一新的 1.5ml 的离心管中。若虫体较小,取一整条虫体经如上洗涤处理。对于鸡球虫,将保存在 2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以 2000g 离心 10min,弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬,同法离心洗涤三次后,用 20%次氯酸钠处理卵囊 20min,2000g 离心沉淀卵囊,用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀,1500g 离心 10min,上清液加入 4 倍体积的灭菌双蒸水,3000g 离心 10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀,然后将其轻轻地加在 0.6M 无菌蔗糖溶液之上,2000g 离心 5min,取上层卵囊加 5
10、倍体积的水,3000g 离心 10min,沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次,即可得纯净的卵囊,可立即用于裂解以提取 DNA。(2)虫体材料的裂解。用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎,加入 280l 的 SDS 裂解缓冲液,轻轻混匀,再加入 20l(25g/l)的蛋白酶 K 溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫,将纯化好的卵囊 3000rpm/min 离心 10min,去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠,漩涡震荡直到有 95卵囊破壁后,即可加入SDS 裂解缓冲液及蛋白酶 K 溶液。混匀后,放于恒温培养箱中,37作用 1248 h,其间不时摇动离心管,使虫体组织裂解充分。(3)虫体
11、 DNA 的抽提和纯化。首先进行虫体DNA提取,然后按Promega公司试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明对DNA进行纯化。方法如下:取出于恒温培养箱中作用了约 20 小时的离心管,旋涡震荡器震荡混匀,10000rpm 离心 2min,上清即为虫体 DNA 溶液。将上清转移至一新的离心管中,加入 1ml 清洗树脂(按 50500l 悬液/1 ml 清洗树脂的比例),旋涡震荡混匀。取一支 5ml 的一次性注射器,去针头,拔出注射器内芯推液筒,接上 WizardTM微型柱。将 DNA-树脂混合液全部转移到注射器中,用注射器内芯推液筒,慢慢地将 DNA-树脂混合液
12、推过微型柱,排出废液。将注射器从微型柱上拔出后,拿去注射器内芯推液筒,再将注射器套在微型柱上,向注射器内加入 2 ml 柱洗溶液(80%的异丙醇),用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱,以洗涤 DNA-树脂样品。拔去注射器,将微型柱套在洁净的 1.5ml 离心管上,10000rpm 离心 20sec,以除去残留的异丙醇。将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上,在柱中央加入 3050l 预热(6070)的超纯水或 1TE 缓冲液,静置 1 min,10000rpm 离心 20sec。离心管内的液体即为 DNA 溶液。可将 DNA 溶液转移至 0.5 ml 离心管中于-20冰箱保存备用。(二)
13、寄生虫 DNA 的 PCR 扩增及琼脂糖电泳 1.实验原理。(1)PCR 引物设计。PCR 反应成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。PCR 引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段,使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以下原则:长度不能太长,也不能太短,一般在 1825 个碱基左右;G+C 含量及 Tm 值:引物的 G+C 含量以 40%60%为宜。引物的 Tm 值是指寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下 50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR 引物应保持合理的 G+C 含量。含有 50%G+C的 20 个碱基的引物其 Tm 值约界于 5662,这可为有效退
14、火提供足够的温度。由于 G+C 间的氢键数较A+T 间多,因此,G+C 含量高的 DNA 片段其 Tm 值也高。对于短于 20 个碱基的引物,Tm 值可按Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物,Tm 值的计算较为复杂。由于 PCR 扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合,因此,反应中退火温度应根据两个 Tm 值折衷选择。碱基的组成尽量随机,尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在;尤其是 3 末端不应超过 3 个连续的 G或 C;引物内部不应有互补序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若引物自身连续互补碱基达 3 个以
15、上,就容易形成发夹结构。两个引物之间不能互补,尤其应避免 3 末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4 个以上的碱基连续相同或互补;引物的 3 末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。如果能确定一个保守氨基酸,可将其密码子的前 2 个碱基作为 3 末端。引物的 5末端可不与目的片段互补,可被修饰而不影响扩增的特异性。引物的 5末端修饰包括:加酶切位点,标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合 DNA 序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的 DNA 上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点,在限制
16、性酶识别序列的 5端常需添加 2-3 个非特异的额外碱基。若是设计种或株特异性引物,引物与非特异序列的相似性不能超过 70%或有连续 8 个以上的互补碱基相同。可用 DNAstar、MegAlign 软件比较相似性,用 Oligo50 来设计引物。(2)PCR 的基本原理。在存在 DNA 模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应混合物中,在热稳定 DNA 聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的 DNA 片段进行扩增。这种扩增是通过模板 DNA、引物之间的变性,退火(复性),延伸三步反应为一周期(cycle),循环进行,使目的 DNA 片段得以扩增。由于每一周期所产生的 DNA 片
17、段均能成为下一次循环的模板,故 PCR 产物以指数方式增加,经 30 个周期后,特定 DNA 片段的数量在理论上可增加 109倍。在实际应用中,一般多用 3035 个循环。(3)琼脂糖电泳的基本原理。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,于沸水中溶解,45开始形成多孔性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场的作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同的 DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化
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