酶细胞原生质体固定化精选课件.ppt
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1、关于酶细胞原生质体固定化1第一页,本课件共有109页2直接应用酶的不足之处直接应用酶的不足之处1.1.酶的稳定性差酶的稳定性差2.2.一次性使用一次性使用3.3.分离纯化较困难分离纯化较困难第二页,本课件共有109页3固定化酶的优点固定化酶的优点1.1.酶的稳定性明显改善;酶的稳定性明显改善;2.2.酶的利用效率高;酶的利用效率高;3.3.易于分离纯化;易于分离纯化;4.4.反应条件易于控制;反应条件易于控制;5.5.适合于多酶催化反应。适合于多酶催化反应。第三页,本课件共有109页4第一节第一节 酶固定化酶固定化定义定义酶的固定化酶的固定化:是通过物理的或化学的手段,将酶束缚于水不溶是通过物
2、理的或化学的手段,将酶束缚于水不溶的载体上,或将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子的自由的载体上,或将酶束缚在一定的空间内,限制酶分子的自由流动,但能使酶充分发挥催化作用。流动,但能使酶充分发挥催化作用。固定化酶固定化酶:固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶化反应的酶;概念发展概念发展“水不溶酶水不溶酶”(water insoluble enzyme)water insoluble enzyme)“固相酶固相酶”(solid phase enzyme)solid phase enzyme)19711971年第一届国际酶工程会议正式采用年第
3、一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶(固定化酶(immobilized immobilized enzyme)”enzyme)”第四页,本课件共有109页5什么是固定化酶?什么是固定化酶?水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶(固定化酶)(固定化酶)固定化技术固定化技术第五页,本课件共有109页6化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶第六页,本课件共有109页7固定化酶制备原则固定化酶制备原则(1 1)维持酶的催化活性及专一性;)维持酶的催化活性及专一性;(2 2)有利于生产自动化、连续化;)有利于生产自动化、连续化;
4、(3 3)应有最小的空间位阻;)应有最小的空间位阻;(4 4)酶与载体必须结合牢固;)酶与载体必须结合牢固;(5 5)应有最大稳定性,载体不与废物、产物或)应有最大稳定性,载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应;反应液发生化学反应;(6 6)成本要低。)成本要低。第七页,本课件共有109页8酶的固定化方法(一)酶的固定化方法(一)固定化方法固定化方法 分类分类非共价结合法非共价结合法结晶法结晶法分散法分散法物理吸附法物理吸附法离子结合法离子结合法化学结合法化学结合法交联法交联法共价结合法共价结合法包埋法包埋法微囊法微囊法网格法网格法一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法第八页,本课件共有109
5、页9酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图第九页,本课件共有109页101 1、吸附法、吸附法(link)(link)2 2、包埋法、包埋法(link)(link)3 3、结合法、结合法(link)(link)4 4、交联法、交联法(link)(link)5 5、热处理法、热处理法(link)(link)go一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法第十页,本课件共有109页111、吸附法、吸附法通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用,将酶电子亲和力等物理作用,将酶固定于水不溶载体上,从而制成固定化酶固定于水不溶载体上,从而制成固定化酶。固体吸
6、附剂固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等等;(1)(1)操作简单,条件温和,不会引起酶变性失活,操作简单,条件温和,不会引起酶变性失活,载体廉价易得,可反复使用载体廉价易得,可反复使用;(2)(2)物理吸附结合能力弱,酶与载体结合不牢固易脱落物理吸附结合能力弱,酶与载体结合不牢固易脱落.back第十一页,本课件共有109页12吸附法吸附法第十二页,本课件共有109页132、包埋法、包埋法l包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合,再包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合,再借助于聚合助进剂借助于聚合助进剂(包括交联剂包括交联剂)的作用进行的作用进行聚合,酶被
7、包埋在聚合物中以达到固定化聚合,酶被包埋在聚合物中以达到固定化。l多孔载体多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等聚酰胺、火棉胶等(1)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法(2)(2)半透膜包埋法半透膜包埋法第十三页,本课件共有109页14第十四页,本课件共有109页152、包埋法、包埋法(1)凝胶包埋法凝胶包埋法l 天然凝胶天然凝胶条件温和,操作简便,对酶活影响小,强条件温和,操作简便,对酶活影响小,强度较差度较差l 合成凝胶合成凝胶强度高,耐温度、强度高,耐温度、pHpH值变化强,因需聚合值变化强,因需聚合反应而使部分酶变性失活反应而使部分酶变性失活l
8、 适用性:适用性:不适用于底物或产物分子很大的酶类的固不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化定化第十五页,本课件共有109页16如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好,机械性能差亲和性好,机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物:合成聚合物:聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好,但有疏水结构机械性能好,但有疏水结构 尼龙尼龙第十六页,本课件共有109页17凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光
9、交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点第十七页,本课件共有109页18聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下:将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN,N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中,再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂),同时,加入1过硫酸钾(引发剂),混合,于25:保温10min,便得含酶凝胶。将凝胶粉碎,制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶,可以在聚合反应开始时,立即转入到疏水相(一种乳化剂,与水相有相同密度)的有机溶液中,使分散成含酶
10、的珠状凝胶。(1)凝胶包埋法凝胶包埋法第十八页,本课件共有109页19l聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失,聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失,以低分子量蛋白质为甚,如果调整交联以低分子量蛋白质为甚,如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。剂浓度与交联程度可以得到克服。聚丙聚丙烯酰胺凝胶包埋法:烯酰胺凝胶包埋法:l APlAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)l TEMED第十九页,本课件共有109页20海藻酸钙包埋法装置海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液,并将水溶性的海藻酸钠配成水溶液,并把酶或细胞分散在其中,然后将其滴把酶或细胞分散在其中,然后将其滴入凝固浴中
11、(常用入凝固浴中(常用CaClCaCl2 2溶液),使海溶液),使海藻酸钠中的藻酸钠中的NaNa+,部分被,部分被CaCa2+2+所取代而所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控第二十页,本课件共有109页21l海藻酸钙凝胶包埋法:海藻酸钙凝胶包埋法:l 滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)第二十一页,本课件共有109页22卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法:l卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖,可以用来包埋酶。具
12、体方法:将酶在37-50溶于水中,又将1.7g卡拉胶在40-60 溶于生理盐水中,二者混合后,趁热滴在0.3mol/L KCl 溶液中硬化,作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。第二十二页,本课件共有109页23 卡拉胶包埋法:卡拉胶包埋法:滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法第二十三页,本课件共有109页24(2)半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜半透膜聚酰胺膜、火棉膜等,孔径几埃至聚酰胺膜、火棉膜等,孔径几埃至几十埃,比酶分子直径小几十埃,比酶分子直径小适用性适用性底物和产物都是小分子物质的酶底物和产物都是小分子物质的酶2、
13、包埋法、包埋法第二十四页,本课件共有109页25微型胶囊法微型胶囊法微型胶囊法微型胶囊法第二十五页,本课件共有109页26微胶囊型固定化酶微胶囊型固定化酶制制备备酶酶+亲水性单体溶于水亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液疏水性单体溶于有机溶液混合混合乳乳化化剂剂乳化乳化酶液分散成小水滴酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成在两相界面上聚合成半透膜,将酶包埋半透膜,将酶包埋Tween-20 破乳破乳离心离心半透膜半透膜酶液滴酶液滴第二十六页,本课件共有109页273、结合法、结合法选择适宜的载体选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键通过载体的共价键或离子键(非
14、共价非共价健健)与酶结合在一起的固定化方法与酶结合在一起的固定化方法酶酶载体载体(1)离子键结合法离子键结合法载体载体:DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、TEAE-TEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶等葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂不溶于水的离子交换剂操作操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少活力损失少,结合力较弱,条件结合力较弱,条件(pH(pH值和离子强度值和离子强度)改变改变时时,酶易脱落酶易脱落第二十七页,本课件共有109页28(1)离子键结合法离子键结
15、合法第二十八页,本课件共有109页29(2)(2)共价键结合法共价键结合法载体分类载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等等;也可分三类也可分三类:天然有机载体天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞)、无机物多糖、蛋白质、细胞)、无机物(玻璃、陶瓷)、合成聚合物(聚酯、聚胺、尼龙)(玻璃、陶瓷)、合成聚合物(聚酯、聚胺、尼龙)方法方法载体活化载体活化:借助某种方法,在载体上引进某一能够借助某种方法,在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点优点:结合很牢固,酶可连续使用较长时间结合很牢固,酶可连续使用较长时
16、间缺点缺点:操作复杂,共价结合可能影响酶的空间构象而影操作复杂,共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性响酶的催化活性3、结合法、结合法第二十九页,本课件共有109页30载体活化方法载体活化方法1 1、重氮法、重氮法;2 2、叠氮法、叠氮法;3 3、溴化氰法、溴化氰法;4 4、烷基化法、烷基化法.第三十页,本课件共有109页31重氮法重氮法将含有将含有苯氨基苯氨基的不的不溶性载体与溶性载体与亚硝酸亚硝酸反应生成重氮盐衍反应生成重氮盐衍生物,使载体引进生物,使载体引进了活泼的重氮基团了活泼的重氮基团第三十一页,本课件共有109页32叠氮法叠氮法含有含有酰肼酰肼基团的载体可用基团的载体可用亚
17、硝酸亚硝酸活化,生成叠氮活化,生成叠氮化合物化合物第三十二页,本课件共有109页33溴化氰法溴化氰法含有含有羟基羟基的载体,如纤维素等,可用的载体,如纤维素等,可用溴化氰溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物活化生成亚氨基碳酸衍生物第三十三页,本课件共有109页34烷基化法烷基化法含含羟基羟基的载体可用的载体可用三氯三氯-均三嗪均三嗪等多卤代物进行等多卤代物进行活化,形成含有卤素基团的活化载体活化,形成含有卤素基团的活化载体back第三十四页,本课件共有109页354、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构交联作用,制成网状结构特点:特点:此法
18、与共价结合法一样也是此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的,所不同的是利用共价键固定酶的,所不同的是不使用载体不使用载体双功能试剂:双功能试剂:戊二醛、己二胺、双戊二醛、己二胺、双偶氮苯等偶氮苯等酶酶双功双功能剂能剂第三十五页,本课件共有109页36双功能试剂:双功能试剂:常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H4、交联法、交联法第三十六页,本课件共有109页37 戊二醛有两戊二醛有两个醛基,均可与个醛基,均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键,此法与共价偶联法利用的均是共价键,
19、不同之处:不同之处:交联法不使用载体。交联法不使用载体。第三十七页,本课件共有109页38第三十八页,本课件共有109页39戊二醛戊二醛:优点:优点:结合牢固,可以长时间使用结合牢固,可以长时间使用缺点:缺点:因交联反应激烈,酶分子多个基因交联反应激烈,酶分子多个基团被交联,酶活损失大,颗粒较小,使团被交联,酶活损失大,颗粒较小,使用不便用不便双重固定化双重固定化将其与吸附法、包埋法联将其与吸附法、包埋法联合使用合使用第三十九页,本课件共有109页40酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联(a)酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶;(b)酶分子被偶联到水不溶性载
20、体上形成水不溶性的固定化酶back第四十页,本课件共有109页415、热处理法、热处理法在一定温度下加热处理一段时间,使酶固在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体体内定在菌体体内适用性适用性热稳定性较好的酶的固定化热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间严格控制加热及其时间back第四十一页,本课件共有109页42 酶的四种固定化方法酶的四种固定化方法第四十二页,本课件共有109页43第四十三页,本课件共有109页44第四十四页,本课件共有109页45固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法 共价结共价结合法合法交联法交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备难易制备难易
21、易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强活力回收活力回收高,酶易流失高,酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能可能可能不能不能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较第四十五页,本课件共有109页46固定化方法的比较l吸附法:条件温和、方法简便、载体可再生。但操吸附法:条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。作稳定性差。l共价法:操作稳定性高。但由于试剂的毒性,共价法:操作稳定性高。但由于试剂的毒性,易引起细胞的破坏。易引起细胞的破坏
22、。l交联法:可得到高细胞浓度,但机械强度低,无法交联法:可得到高细胞浓度,但机械强度低,无法再生,不适于实际应用。再生,不适于实际应用。l包埋法:细胞和载体间没有束缚,固定化后,细包埋法:细胞和载体间没有束缚,固定化后,细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。底物。第四十六页,本课件共有109页471 1、稳定性、稳定性(link)(link)2 2、最适温度、最适温度(link)(link)3 3、最适、最适pH(link)pH(link)4 4、底物特异性、底物特异性(link)(link)go二、固定化酶的特性二、固定化酶的特性第四十七
23、页,本课件共有109页481、稳定性、稳定性相对游离酶的优点相对游离酶的优点(1 1)对热的稳定性提高,可以耐受较高的温度)对热的稳定性提高,可以耐受较高的温度A固定化酶固定化酶B游离酶游离酶第四十八页,本课件共有109页49(2 2)保存稳定性好,保存时间延长)保存稳定性好,保存时间延长(3 3)对蛋白酶的抵抗性增强,不易被蛋白)对蛋白酶的抵抗性增强,不易被蛋白酶水解酶水解(4 4)对变性剂)对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍如尿素、有机溶剂、盐酸胍等等)的耐受性提高,保留较高酶活的耐受性提高,保留较高酶活(5 5)对酶抑制剂、对不同)对酶抑制剂、对不同pHpH稳定性提高稳定性提高.1、稳定
24、性、稳定性第四十九页,本课件共有109页50 可能的原因:可能的原因:固定化增加了酶活性构象的牢固程度,固定化增加了酶活性构象的牢固程度,可防止酶分子伸展变形;可防止酶分子伸展变形;抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。的侵袭。1、稳定性、稳定性第五十页,本课件共有109页512、最适温度、最适温度与游离酶差不多与游离酶差不多A固定化酶固定化酶B游离酶游离酶第五十一页,本课件共有109页52例外例外1.1.用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,比游离酶高比游离酶高5-10;
25、5-10;2.2.以共价结合法固定的色氨酸酶,比游离酶高以共价结合法固定的色氨酸酶,比游离酶高5-5-1515;3.3.汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80 80 ,比固定化前提高了,比固定化前提高了30 30 同一种酶同一种酶2、最适温度、最适温度第五十二页,本课件共有109页53不同方法和载体固定化氨基酰不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度化酶的最适温度(back)载体载体 方法最适温度最适温度()游离游离 60 60DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶离子键结合法离子键结合法 72 72DEAE-DEAE-纤维素纤维素离子键
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