测序图分析(20220301160251).pdf
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1、测序常见峰图及原因说明1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂?2.什么是碱基缺失?3.什么是引物不纯?4.重复结构对测序有哪些影响?5.什么是模板不单一?6.Poly结构的测序结果是怎样的?7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的?8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的?9.测序峰图为后双峰是什么样的?10.无信号的结果:信号值(ATGC的平均值)皆小于 10011.飘峰:这是由于用3.0 特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移12.没有任何干扰的结果Q-1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂?返回顶端A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目
2、的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR 扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观,可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是,高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果,如果您对 PCR 产物的纯度不很确定,希望您可以将 PCR产物进行克隆处理,以确保得到好的测序结果。以下图为例:该反应的背景信号较高,不利于碱基的判读。查看大图解决办法:改变 PCR 条件,重新扩增。或者可以将该 PCR产物克隆到质粒中,初步筛选后进行单克隆测序。Q-2.什么是碱基缺失?返回顶端A-2.以下图为例:查看大图碱基缺失常见在 PCR 产物中,特别是从基因组中扩增得到的PCR 片段,上图的
3、186 位缺失两个连续的T 解决方法:(1)使用反向引物继续测序,以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR 产物克隆到质粒中,挑取单克隆测序。(2)如果可以确定该 PCR片段中不应该有缺失的位点,那么可以改变PCR 反应条件,重新扩增。Q-3.什么是引物不纯?返回顶端A-3.以下图为例:查看大图引物不纯造成移码现象,该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂,但是引物不纯在峰图上表现的更有规律,一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。解决办法:重新合成引物,或者将引物进行PAGE 纯化后再进行测序。Q-4.重复结构对测序有哪些影响?返回顶端A-4.以下图为例:查看大图重复结构将导致
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