《制备HPLC技术》PPT课件.ppt
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1、制备制备HPLCHPLC技术技术主要内容主要内容第一部分.制备HPLC概述第二部分.制备HPLC技术问题 上样 条件的选择 馏分的收集 循环色谱 柱切换第一部分制备HPLC概述制备型液相色谱制备型液相色谱:结构与分析型一样,但泵流量大、进样量大、采用制备柱;柱后馏分收集器。制备HPLC概述制备HPLC概述制备HPLC与 分析HPL比较目的填料流量流通池联系制备HPLC样品中特定成分的高纯度获取,大量、廉价的制备20以上为佳0.1-150ml/min最大允许流速可为150mL/min在进行制备HPLC之前,常先进行分析HPLC实验,对分析方法进行优化、放大应用到制备HPLC中,详见后。分析HPL
2、C定性分析:检测的灵敏度定量分析:分离度、再现性3-50.001-9.999ml/min一般的分析池的最大允许流速仅为5mL/min,或者10mL/min制备HPLC概述主要结构单元输液部:输液泵shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备)分离部:制备柱内径2050mm,柱长50cm。检测部:检测器shimadzuSPD-M10Avp馏分部:馏分收集器shimadzuFRC-10A制备HPLC概述制备泵的耐压 制备HPLC系统因制备柱的填料很细,分离度好,同时反压很高,整个系统对压力很敏感,制备泵要求能在制定的恒流量下,克服100-150 bars反压色谱柱的柱容量(柱负
3、荷)色谱柱的柱容量(柱负荷)对分析柱:对分析柱:不影响柱效时的最大进样量;对制备柱:对制备柱:不影响收集物纯度时的最大进样量;超载:超载:进样量超过柱容量。柱效迅速下降,峰变宽。超载可提高制备效率,以柱效下降一半超载可提高制备效率,以柱效下降一半或容量因子或容量因子k k降低降低10%10%为宜。为宜。制备HPLC概述柱容量制备HPLC概述分离效能取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。增加洗脱液流速会降低分辨率,分辨率也会因上样量过大而下降。但分辨能力并不总是制备HPLC首要考虑的因素,制备型HPLC应首先具有经济、快速的生产所需产品的能力。分辨率速度
4、载样量制备HPLC概述应用举例在许多分离工作中,需要从大量的物质中分离纯化不足的所需成分,这种分离工作十分困难,在纯化的最后阶段常需使用m或更小颗粒的高效填料。为获得所需微量组分,可采用如下手段:制备型分离-半制备型分离-分析型分离-产物。制备HPLC有关技术问题 第二部分制备HPLC技术问题超量载样在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级,甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:100000,进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积(小于1:100)。在这种条件下,会达到很好的分离效果,峰形尖锐并且很对称。而在制备液相中,最大的区别就是超量进样。制备HPLC采用超量进样的原因:大样品量的纯化方
5、法分析系统的放大:使用直径更大的制备柱、更高的流速,根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变,峰形尖锐而对称。需大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品,不经济色谱柱超量载样:相同的条件下超量进样浓缩法和体积超载法制备HPLC技术问题超量载样浓缩法超量载样体积法超量载样提高样品的浓度,保持进样体积不变;取决于组分在流动相中的溶解度;生产效率决定于选择性;受固定相粒度大小的影响不大取决于进样体积,生产效率决定于制备柱直径,需要小颗粒填料。VS容量因子降低,峰形从高斯曲线变为三角形峰高不变,峰变宽并呈矩形制备HPLC技术问题超量载样注意!应尽可能选用流动相来溶解样品,但应注意样品在流动相中应有
6、良好的溶解度。同时,若样品体积太大,分辨能力就会下降;若样品过浓,则可能在柱的顶部形成沉淀。尽管如此,为每次可分离得到更多的样品,还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品。可将样品溶于不同于流动相的溶剂,但用此法时需很谨慎。制备HPLC技术问题超量载样 分析HPLC进样量远远小于柱子的载样极限,样品在柱子里的分配几乎是理想的,而制备通常都会对上样到一定的过载,主要组分的量在柱子里分配已经和分析情况很不相同,通常在增加到一定进样量后,分离效果都会不同程度的变差!制备HPLC的首要问题是快速、高效的制备色谱纯的产品!分离度在制备HPLC中并不是首先要关注的问题,色谱峰会比较难看!制备HPLC技术问题
7、样品的纯化 在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是提高效率降低成本的优化措施.比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的收率,所以使用的仪器和填料可能是昂贵的.未经预纯化的样品,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很快失效.此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进样量和生产效率.同时分别用正反相色谱去除前后杂,比单用一种色谱得到目标产物更简单易行.总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术上可行的方法,而且要综合考虑成本.制备HPLC技术问题应用举例 样品如果溶解度太低如何上制备?样品如果溶解度太低如何上制备?在制
8、备系统溶剂中,样品如果溶解度太低,估计,该如何处理?(70甲醇水)不可能为了50mg 而上1000ml溶液吧?如果用纯甲醇做溶剂,会导致样品析出,如果用纯甲醇做流动相,那柱子根本无保留!问题样品可能某种晶型难溶,这样可以加入其他溶剂(如丙酮等)以助溶如果不是蛋白质等大分子,试一下DMSO或DMF加入少量二氯甲烷,也有助于改善样品的溶解性 对溶解不好的小极性分子更常用的是THF/H2O 流动相是甲醇:水:。应该能用甲醇溶样。因为流动相很快,能很快稀释样品溶液 另外制备HPLC中常见而又不太好解决的问题回答制备HPLC技术问题应用举例可以采用预装柱形式:先将样品和少量填料(粉)混合,搅拌均匀,然后
9、将此部分硅胶装到一小柱内。在洗脱时,先让洗脱液通过此小柱,然后在上分离柱(干法上样)。此方法对不溶性样品或不能用溶剂溶解的样品很有效,同时分离效果也会提高 用正相色谱比用反相色谱更适合这个样品。一是解决了溶解的问题。二是分离度方面有意想不到的收获。如果多肽类,调一下PH值常常会得到很满意的效果 首先如果调节PH值可以溶最好,不行用甲醇乙腈,DMSO,THF,最好每次只加一种溶剂 试溶注意!固体上样制备HPLC技术问题应用举例 如果样品溶解在高比例甲醇中,上样体积一定要小,否则就会不保留原因是大量强极性的样品溶剂破坏了柱平衡有时会看到陡的前沿和长拖尾甚至同一样品出两个峰DMSO可能对柱子不是很好
10、 顺序也很重要,比如,先加水再加甲醇不溶,先加甲醇再加水就溶了 用二氯甲烷可能的问题是不混溶 注意问题 上样量的调整:上样量的调整:mp/ma=lp/la *r2p/r2aL:柱长;柱长;m:进样量;:进样量;r:色谱柱内径:色谱柱内径 p:制备柱;制备柱;a:分析柱:分析柱制备HPLC技术问题上样量的选择 上样量主要根据a、柱子的大小b、样品的浓度c、制备是否根据分析条件放大(例如制备柱是否还用分析用填料)根据内径计算:内径放大N倍,进样量大致可放大N平方倍(柱长一定时)将分析色谱上的结果放大到制备色谱中:制备HPLC技术问题条件的选择 通常采用将分析HPLC上的条件进行优化、放大后应用到制
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