血清碱性磷酸酶活性测定学习资料.ppt
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1、血清碱性磷酸酶活性测定 实验目的掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中ALP活力测定方法掌握血清中ALP测定的临床意义 思考思考?如何测定酶活力的大小如何测定酶活力的大小?酶活力酶活力:酶催化某一化学反应的能力,其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力,其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力,其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力,其衡量的标准是酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。酶促反应的速度:酶促反应的速度:常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。反应速度反应速度反应速度反应速度 活力活力活力活力酶活力测定方法 终止测定法(或定时法):终止测定
2、法(或定时法):终止测定法(或定时法):终止测定法(或定时法):*本次实验的方法本次实验的方法本次实验的方法本次实验的方法 通常是酶作用一段时间后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶通常是酶作用一段时间后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应的平促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应的平促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应的平促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成
3、量,计算酶促反应的平均速度。均速度。均速度。均速度。连续监测法:连续监测法:连续监测法:连续监测法:连续监测法是指每隔一定时间(连续监测法是指每隔一定时间(连续监测法是指每隔一定时间(连续监测法是指每隔一定时间(2 260s60s),连续多次测定酶反),连续多次测定酶反),连续多次测定酶反),连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据,求出酶反应初速应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据,求出酶反应初速应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据,求出酶反应初速应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法。度,间接计算酶活性浓
4、度的方法。度,间接计算酶活性浓度的方法。度,间接计算酶活性浓度的方法。适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测什么是ALP?碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALP是一组在是一组在碱性环境碱性环境中中水解磷酸酯水解磷酸酯的酶类。的酶类。来源:广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、来源:广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位,但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较胆汁等部位,但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人血
5、清中多。正常人血清中ALP主要来源于主要来源于肝脏肝脏。是一种能够将对应底物是一种能够将对应底物去磷酸化去磷酸化的酶,即通过水的酶,即通过水解磷酸单酯将底物分子上的解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团磷酸基团除去,并生除去,并生成成磷酸根离子磷酸根离子和和自由的羟基自由的羟基,这类底物包括核酸、,这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。实验原理实验原理测定测定ALP的方法主要分为两种的方法主要分为两种一是测定底物解离下的一是测定底
6、物解离下的磷酸根磷酸根来计算酶活力来计算酶活力,如如-甘油磷酸钠法,但存在血清本身有磷酸根甘油磷酸钠法,但存在血清本身有磷酸根的缺点;的缺点;二是测定底物解离磷酸根后的二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物羟基化合物,这,这种方法又可分为:种方法又可分为:酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。生成的酚化合物本身在一定的条件下就可生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色,如对硝基苯磷酸二钠(显色,如对硝基苯磷酸二钠(PNPP)法)法 在PH=10的环境中,ALPALP催化磷酸苯二钠磷酸苯二钠水解 苯酚苯酚和磷酸氢二钠磷酸氢二钠苯酚苯酚与4-4-氨基安替比林氨基
7、安替比林 色素原色素原该色素原经铁氰化钾铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物醌亚胺衍生物测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H+H2 2O O(ALP,PH=10)苯酚+磷酸氢二钠苯酚苯酚苯酚苯酚+4-+4-氨基安替比林氨基安替比林氨基安替比林氨基安替比林(铁氰化钾)(铁氰化钾)(铁氰化钾)(铁氰化钾)醌亚胺衍生物醌亚胺衍生物试剂与仪器试剂与仪器(一)(一)0.1mol/L 0.1mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(含(含(含(含4-4-氨基安替比林)氨基安替比林)氨基安替比林)氨基安替比林)4-4-氨基安替比林:氨基安替比
8、林:氨基安替比林:氨基安替比林:淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点淡黄色结晶。熔点109109。溶于水、苯和乙醇,微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇,微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇,微溶于乙醚。溶于水、苯和乙醇,微溶于乙醚。4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关,需准确加入。铁氰化钾用量不一氨基安替比林用量与吸光度成正相关,需准确加入。铁氰化钾用量不足时,反应不完全,测量结果偏低,因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量足时,反应不完全,测量结果偏低,因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量(二)(二)20mmol/L20mmol/L磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液磷酸苯二钠溶液(三)(三)
9、铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液铁氰化钾的硼酸溶液(四)(四)酚标准工作液酚标准工作液酚标准工作液酚标准工作液器材:器材:器材:器材:5ml 5ml移液管、移液管、移液管、移液管、1ml1ml移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、移液管、加样枪、分光光度计、1cm1cm比色皿比色皿比色皿比色皿 37C 37C水浴锅水浴锅水浴锅水浴锅实验操作实验操作取取取取4 4 4 4支试管,如下操作:支试管,如下操作:支试管,如下操作:支试管,如下操作:立即混匀。用立即混匀。用510nm510nm波长(红色醌物质的最大吸收波长)比色,波长(
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