乙肝病毒cccDNA检测.ppt
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1、 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒cccDNAcccDNA 检测方法与应用价值检测方法与应用价值一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介什么是什么是HBV cccDNA?HBV cccDNA?即即 共共 价价 闭闭 合合 环环 状状 DNADNA(covalently covalently closed closed circular circular DNA)DNA)。乙乙肝肝病病毒毒感感染染宿宿主主细细胞胞后后在在细细胞胞内内复复制制并并建建立立感感染染状状态态,病病毒毒松松弛弛环环状状DNADNA(rcDNArcDNA)进进入入细细胞胞核核,利利用用宿宿主主DNADNA聚聚合合酶酶和和拓拓扑扑酶
2、酶等等“修修复复”形形成的、结构完整的、超螺旋双链成的、结构完整的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒基基因因组组结结构构示示意意图图乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒的的复复制制过过程程我们为什么要关注我们为什么要关注HBV cccDNA?HBV cccDNA?cccDNAcccDNA存存在在于于细细胞胞核核内内,成成为为乙乙肝肝病病毒毒的的复复制制“池池”目前尚没有可以进入细胞核内,并能够清除目前尚没有可以进入细胞核内,并能够清除cccDNAcccDNA 的药物,这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治的药物,这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一疗后容易复
3、发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNAcccDNA,成为肝脏,成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的还没有稳定、可靠、敏感的cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术的时间不长研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模,不能满足临床检验的需求模,不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高,检测低限现有技术灵
4、敏度不高,检测低限10104 4 copycopy /ml /ml左右左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足,存在缺陷识不足,存在缺陷多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存(cccDNA(cccDNA、rcDNA rcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBV DNAHBV DNA),必须有),必须有 效地分离效地分离cccDNAcccDNA和其他类型的病毒和其他类型的病毒DNADNA如何进一步解决特异性的问题?如何进一步解决特异性的问题?如何解决灵敏度不高的问题(细胞内如何解决灵敏度不高的问题(细胞内cccDNA
5、cccDNA 含量的较低),血清中含量?含量的较低),血清中含量?如何简化检测步骤?如何简化检测步骤?建立建立cccDNAcccDNA检测技术必须克服的难点检测技术必须克服的难点cccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状,超螺旋闭合环状,超螺旋松弛环状,非超螺旋松弛环状,非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性对某些核酸酶抗性强,不容易被降解强,不容易被降解弱,容易被降解弱,容易被降解分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的分子
6、基础的分子基础分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差异的任何手段均基于上述差异二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法(侵入者探针法(Invader assaayInvader assaay)3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套
7、式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法(侵入者探针法(Invader assaayInvader assaay)3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法设计一对特殊引物:跨设计一对特殊引物:跨双双缺口引物缺口引物 正义引物正义引物P1 P1:与负链互补结合,位于正:与负链互补结合,位于正 链缺口上游链缺口上游 反义引物反义引物P2 P2:与正链互补结合,位于负:与正链互补结合,位于负 链缺口下游链缺口下游目的:目的:rcDNArcDNA不被扩增不被扩增1.1.选择性选择性PCRPCR选择性选择性PCR:rcDNA不被扩增不被扩增选择性选择性PCRPCR:c
8、ccDNAcccDNA能被扩增能被扩增PCR产物自身退火(产物自身退火(self annealing)“选择性选择性”PCR”PCR:并非万无一:并非万无一失失 rcDNArcDNA被被大大量量扩扩增增,阳阳性性结结果果不不可可靠靠,定定量量结结果果也不可靠也不可靠 HepatologyHepatology Research 2003;15:234-243 Research 2003;15:234-243(PBMCPBMC)World J World J GastroenterolGastroenterol 2004;10(1):82-85(2004;10(1):82-85(血清血清)l Ko
9、ckKock等:反应管中等:反应管中rcDNArcDNA含量不能超过含量不能超过10105 5copycopy HepatologyHepatology 1996;23:405-4131996;23:405-413 血血清清HBV HBV rcDNArcDNA超超过过10108 8copy/mlcopy/ml,进进行行荧荧光光PCRPCR可能会出现检测结果假阳性可能会出现检测结果假阳性“选择性选择性”PCR”PCR:并非万无一:并非万无一失失 与与定定性性法法比比较较增增加加了了一一个个荧荧光光探探针针,探探针针位位于于扩扩增增片片段段区区(负负链链缺缺口口下游),与下游),与cccDNAcc
10、cDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNArcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+3200(1)EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理l 标准曲线方程标
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