植物组织与细胞培养技术.ppt
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1、第二章第二章 植物组织与器官培养植物组织与器官培养第一节第一节 基础知识基础知识第二节第二节 组织培养的一般过程组织培养的一般过程第三节第三节 植物组织器官培养植物组织器官培养第四节第四节 细胞培养细胞培养第五节第五节 植物原生质体培养植物原生质体培养 组织培养与细胞培养的区别:v组织培养:指取出机体内组织与细胞,模拟机体内生理条件,使之在体外生长成组织或完整植株;v细胞培养:植物细胞在体外条件下的存活或生长,不再形成组织,以生产次生代谢产物为目的。第一节第一节 基础知识基础知识CloneClone分动词和名词。动词为无性繁殖,名分动词和名词。动词为无性繁殖,名词为无性繁殖后代(无性系)。通俗
2、地讲就词为无性繁殖后代(无性系)。通俗地讲就是是GeneticallyGenetically replicate or copyreplicate or copy.CallicloneCalliclone(愈伤组织无性系)愈伤组织无性系)ProtocloneProtoclone(原生质体无性系)(原生质体无性系)SomacloneSomacloneGametocloneGametoclone等等Plant tissue culture:将将整整个个植植株株、器器官官、组组织织、细细胞胞、甚甚至至细细胞胞器器进进行行离离体体的的无无菌菌的的培培养养(广广义义)。诱导愈伤组织进而再增殖分化的培养技
3、术(狭义)诱导愈伤组织进而再增殖分化的培养技术(狭义)。Explant:用于离体培养的植物组织切段。用于离体培养的植物组织切段。Organ Culture:根、茎、叶、花、果实、种子等。根、茎、叶、花、果实、种子等。Suspension cell culture:液液体体中中分分散散良良好好的的细细胞胞或或小小细胞团的培养。细胞团的培养。Callus(pl Calli)愈愈伤伤组组织织:由由母母体体组组织织脱脱分分化化产产生生的的一一团团不不定定型型的的疏疏松松的的薄薄壁壁细细胞胞。没没有有明明显显的的器器官官组组织织分分化化。但但是是细细胞胞大大小小、形形态态、液液泡泡化化程程度度、细细胞胞
4、质质含含量量、细细胞胞壁壁的的特特性性等等与与正正常常组组织织存存在在很很大大的的差异差异。Organ formation/genesis:愈愈伤伤组组织织分分化化形形成成根根和和芽的过程。芽的过程。Embryoid(胚胚状状体体):指指在在组组织织和和细细胞胞培培养养中中,起起源源于于非非合合子子细细胞胞,经经过过多多次次分分裂裂产产生生的的一一种种与与胚胚相相似似的的结结构。构。1.是是组组织织和和细细胞胞培培养养的的产产物物,以以区区别别自自然然界界中中无无融融合合生生殖殖(Apomixes)产产生生的的胚胚;2.起起源源于于非非合合子子细细胞胞以以区区别别于于精精卵卵结结合合而而形形成
5、成的的合合子子胚胚(Zygotic embryo);3.具具有有胚胚根根胚胚芽芽和和胚胚轴轴的的完完整整结结构构并并与与外外植植体体的的维维管管组织无联系而区别于组织培养中的不定芽或不定根。组织无联系而区别于组织培养中的不定芽或不定根。Artificial/Synthetic/Man-made/Somatic seed:将将植植物物离离体体培培养养产产生生的的胚胚状状体体(主主要要指指体体细细胞胞胚胚)包包裹裹在在含含有有养养分分和和具具有有保保护护功功能能的的物物质质中中形形成成的的在在适应条件下能够发芽出苗的颗粒体适应条件下能够发芽出苗的颗粒体 人工种子人工种子是由体细是由体细胞胚、人工胚
6、乳和人胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成工种皮三个部分组成优点优点:(1 1)难以保存的种质资源)难以保存的种质资源(2 2)固定杂种优势)固定杂种优势(3 3)可加入农药肥料及激素,人为控制植物)可加入农药肥料及激素,人为控制植物 的生长发育和抗逆性的生长发育和抗逆性(4 4)是植物基因工程和细胞工程应用于生产)是植物基因工程和细胞工程应用于生产 的桥梁。的桥梁。人工种子存在的问题人工种子存在的问题许许多多重重要要植植物物还还不不能能培培养养出出大大量量的的高高质质量量的的体体细胞胚细胞胚;现现有有的的人人工工胚胚乳乳和和种种皮皮还还不不够够理理想想,不不能能有有效效地防止微生物的腐蚀地防
7、止微生物的腐蚀;人工种子的贮藏有待进一步完善。人工种子的贮藏有待进一步完善。茎尖分生组织培养再生植株Shoot tip culture:几几mmmm至几十至几十mmmm的茎尖的茎尖病毒检测脱毒苗的繁殖一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度,取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。第二类第二类第三类第三类根据细胞类型不同从强到弱根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心营养生长中心 形成层形成层 薄壁细胞薄壁细胞 厚壁细胞(木厚壁细胞(木质化细胞)质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)根据细胞所处的组织不同从强到弱:根据细胞所处的组织不同从强到弱:顶端分生组织顶端分生组
8、织 居间分生组织居间分生组织 侧生分生组织侧生分生组织 薄薄壁组织(基本组织)壁组织(基本组织)厚角组织厚角组织 辅导组织辅导组织 厚壁厚壁组织组织细胞分生能力比较外植体外植体脱分化脱分化个体再生个体再生再分化再分化细胞分裂细胞分裂细胞全能性的表达是通过细胞全能性的表达是通过细胞脱分化细胞脱分化和和再分化再分化实现的,在实现的,在大多数情况下,脱分化是细胞全能性表达的前提,再分化大多数情况下,脱分化是细胞全能性表达的前提,再分化是细胞全能性表达的最终体现。是细胞全能性表达的最终体现。细胞脱分化细胞脱分化1 1、脱分化(、脱分化(DedifferentiationDedifferentiatio
9、n):):也称去分化,指离体也称去分化,指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态失去原来的结构和功能而恢复分生状态,形成无组,形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。(1 1)损伤损伤。切割损伤的刺激,促使细胞增殖。切割损伤的刺激,促使细胞增殖。(2 2)激素。激素。(3 3)弱光或黑暗条件弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。有利于脱分化中的细胞分裂。(4 4)细胞位置细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激。外植体本身的
10、各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。有不同的敏感性。(5 5)外植体的生理状态外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。的培养反应。(6 6)植物种类的差异植物种类的差异。一般双子叶植物比单子叶植物及裸子一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。植物容易。影响脱分化的主要因素影响脱分化的主要因素u诱导期诱导期:是细胞准备分裂的时期。细胞大小不变,内:是细胞准备分裂的时期。细胞大小不变,内部发生生理生化变化,迅速合成蛋白质和核酸。部发生生理生化变化,迅速合成蛋白质和核酸。u分裂期分裂期:诱导期后,外植体外层细胞分裂,在组织受诱导期后,
11、外植体外层细胞分裂,在组织受伤表面形成一层愈伤组织,伤表面形成一层愈伤组织,中间细胞常不分裂,形成中间细胞常不分裂,形成小芯小芯。细胞分裂快,结构疏松,缺少结构,浅而透明。细胞分裂快,结构疏松,缺少结构,浅而透明。质地类型:质地类型:松脆和致密松脆和致密两种。高浓度生长素,可使两种。高浓度生长素,可使Callus变得松变得松脆;高浓度细胞分裂素,则可使致密脆;高浓度细胞分裂素,则可使致密 脱分化过程脱分化过程 (愈伤组织形成)(愈伤组织形成)黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织 细胞再分化(细胞再分化(redifferentiationredifferent
12、iation)1 1、概念、概念 :指离体培养的植物细胞和组织可以由:指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化,形成另一种或几种类型脱分化状态重新进行分化,形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官,甚至形成完整植株。的细胞、组织、器官,甚至形成完整植株。1 1 实验室设计与设备实验室设计与设备2 2 实验基本操作实验基本操作3 3 培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制4 4 培养条件的选择培养条件的选择组织培养的一般过程组织培养的一般过程实验室设计原则实验室设计原则:保证无菌操作,达到工作方便,防止污染。v利用利用一一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计,定的设备、器材和特殊的
13、实验室结构设计,达到严格无菌的条件达到严格无菌的条件v按按组织培养流程组织培养流程来设计,避免某些环节倒排,引来设计,避免某些环节倒排,引起日后工作混乱起日后工作混乱一、实验室设计与设备一、实验室设计与设备基本的工艺流程:基本的工艺流程:基本的工艺流程:基本的工艺流程:容器具洗涤,物质准备容器具洗涤,物质准备配置培养基并灭菌配置培养基并灭菌外外植体消毒与无菌操作接种植体消毒与无菌操作接种观察、记录、处理观察、记录、处理(脱分化、再分化、继代)(脱分化、再分化、继代)再生植株再生植株 标准的组培实验室标准的组培实验室洗涤室、准备室、无菌室、培养室等洗涤室、准备室、无菌室、培养室等灭菌设备:高压蒸
14、气灭菌锅灭菌设备:高压蒸气灭菌锅用于用于培养基、蒸馏水和接种器械培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。的灭菌消毒。工作原理:在密闭的蒸锅内,工作原理:在密闭的蒸锅内,0 01MPa1MPa的压力下,锅内温的压力下,锅内温度达度达121121。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。其高度耐热的芽孢。注意事项:注意事项:对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力延长灭菌时间或提高压力。而培养基要。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防
15、止培养基中严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间;的成分变质或效力降低,不能随意延长时间;高压灭菌前后的培养基,其高压灭菌前后的培养基,其pHpH值下降单位。因此,调值下降单位。因此,调PHPH值时,可适当值时,可适当调高调高0.0.2 20.30.3个单位。个单位。(2).(2).接种设备:接种设备:无菌超净工作台用于培养无菌超净工作台用于培养材料的消毒及接种材料的消毒及接种。使用前,将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启,灭菌使用前,将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启,灭菌15min15min后,后,关闭杀菌按钮,打开照明按钮,即可在上面进行
16、操作。关闭杀菌按钮,打开照明按钮,即可在上面进行操作。酒精灯酒精灯封口膜封口膜接种器具接种器具培养瓶培养瓶(3).(3).培养设备培养设备带日光灯的培养架,主要用于接种后材料的培养。带日光灯的培养架,主要用于接种后材料的培养。恒温箱:恒温箱:又称培养箱,可用于原生质体又称培养箱,可用于原生质体和酶制剂的保温,也可用于组织培养材和酶制剂的保温,也可用于组织培养材料的保存及暗培养。料的保存及暗培养。摇床:摇床:在液体培养基中,可改善培养基中的培养在液体培养基中,可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及
17、转速。细胞。但注意要设定适合的温度及转速。(4).驯化设备驯化设备温室温室防虫网室防虫网室(5)(5)、其它辅助设备、其它辅助设备培养基灌装机及洗瓶机培养基灌装机及洗瓶机烘箱烘箱:用于干燥洗净后的玻璃器皿,还可用80的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。冰箱:冰箱:用于在常温下易变用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储性或失效的试剂和母液的储藏,细胞组织和试验材料的藏,细胞组织和试验材料的冷冻保藏,以及某些材料的冷冻保藏,以及某些材料的预处理。预处理。天平和显微镜:天平和显微镜:天平包括分析天平包括分析天平,电子天平等,用于制备母天平,电子天平等,用于制备母液时培养基组成成分的称取。如液时
18、培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类一些需要量少的激素和微生素类物质,天平的精确度要到物质,天平的精确度要到0.0001g0.0001g,这就要求精确度更高,这就要求精确度更高的分析天平。的分析天平。纯水机与蒸馏水发纯水机与蒸馏水发生器:生器:是实验室必备的仪器。酸度计酸度计:用于校正培养基和酶制剂的PH。显微镜显微镜包括解剖镜,生物显微镜,倒置显微镜包括解剖镜,生物显微镜,倒置显微镜等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。除湿机除湿机:使培养室的湿度保持在定的范围内。空调机空调机:用于接种室和培养室温度的控制。实验基本操作实验基本操作 灭菌工作
19、是极其重要的灭菌工作是极其重要的有菌有菌和和无菌无菌的范畴:的范畴:有菌:有菌:凡是暴露在空气中的物体,至少其表面都是有凡是暴露在空气中的物体,至少其表面都是有菌的。菌的。如植物的表面、超净工作台的台面,未处理的如植物的表面、超净工作台的台面,未处理的工具和手等工具和手等。无菌无菌:高压高温处理(工具、器皿、培养基等):高压高温处理(工具、器皿、培养基等)物理或化学处理;物理或化学处理;火烤后的物体;火烤后的物体;健康的动植物不与内外部表面接触的组织健康的动植物不与内外部表面接触的组织 1 1、物理方法物理方法:干热、湿热、过滤(:干热、湿热、过滤(0.250.25微微米)米)、紫外灯、超声波
20、等。、紫外灯、超声波等。2 2、化学方法化学方法:使用灭菌剂或抗菌素,如酒:使用灭菌剂或抗菌素,如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等双氧水、福尔马林等 灭菌的方法适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法:适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法:150 150、40min40min或或120 120、120min120min,如果发现,如果发现芽孢芽孢杆菌杆菌,160 160、9090120min120min(1)干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸蒸馏水、棉塞、纸等。等。121 12
21、1 维持维持202030min30min(2)湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果培培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果培养基中某些成分遇到养基中某些成分遇到高温分解高温分解(如某些生长调节剂(如某些生长调节剂GAGA3 3、IAAIAA 、抗生素等),就需要过滤灭菌。另外、抗生素等),就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌酶、血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度,灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度,用注射器注入微孔滤膜,滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜,滤膜孔径0.220.220.450.45微米。微米。制培养基时,现将培养基高压灭菌,待降至制培养
22、基时,现将培养基高压灭菌,待降至5050左左右右时,加入适量的激素,然后分装。时,加入适量的激素,然后分装。(3)过滤灭菌主要是利用主要是利用紫外灯紫外灯进行照射,适合实验室进行照射,适合实验室空气、操作台等,灭菌时间空气、操作台等,灭菌时间202030min30min。(4)射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的,适用于用火焰灼烧达到灭菌目的,适用于接种器皿接种器皿的灭菌。的灭菌。(5)火焰灼烧灭菌适用适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(m
23、in.)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗生素抗生素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/纳纳9 9 10105 53030好好易易(6)消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法:长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法:甲甲醛、高锰酸钾熏蒸。醛、高锰酸钾熏蒸。(7)熏蒸灭菌人为因素(工作人员本身):工作服、帽、
24、口罩(紫外)、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿:洗干热和湿热玻璃器皿:洗干热和湿热接种用具:泡75%-烧干热和湿热培养基:湿热培养材料外部细菌:用水冲洗消毒剂处理内部细菌茎尖培养加抗生素:青霉素、利福平操作的空气:洗刷地板75%酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸,紫外污染来源接种操作应在接种操作应在近火焰处近火焰处进行,且动作要迅速进行,且动作要迅速接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口瓶盖朝上放,接种完毕后立即盖好瓶口培养基及其配制培养基及其配制培养基培养基(culture medium)(culture medium)根据植物生长所需营养根据植物生长所
25、需营养成分,配制成的供植物生长的成分,配制成的供植物生长的人工制作的营养物质人工制作的营养物质。是植物组织培养的重要基质。是植物组织培养的重要基质。v不同植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种不同植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同植物不同部位的组织对营养的要求也不相同v没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官官一培养基成分一培养基成分主要为:主要为:水水无机盐:无机盐:大量和微量元素大量和微量元素有机化合物:有机化合物:维生素,氨基酸维生素,氨基酸碳源和能源:碳源和能源:糖糖生长调节物质:生长调节物
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