实验二质粒DNA的酶切鉴定.ppt
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1、实验二实验二 质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳1.实验目的和要求实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的重组技术的关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。2.相关基础知识相关基础知识 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶:是是一一类类能能识识别别双双链链DNA分分子子特特异异性性核核酸酸序序列列的的DNA水水解解酶酶。是是体体外外剪剪切切基基因因
2、片片段段的的重重要要工工具具,所所以以常常常常与与核核酸酸聚聚合合酶酶、连连接接酶酶以以及及末末端端修修饰饰酶酶等等一一起起称称为为工工具具酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶不不仅仅是是DNA重重组组中中重重要要的的工工具具,而而且且还还可可以以用用于于基基因因组组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。1)寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶,链的核酸内切酶,它们以此来限制外源它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内,但合成
3、存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了不受影响,因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限进行了修饰,限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。不能起作用。这种现这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。象被称为寄主控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及以及切切断核酸的情况不同,分为三类断核酸的情况不同,分为三类:型型 型型*型型第一类(第一类(I I型)限制性内切酶型)限制性内切
4、酶能识别专一能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割核苷酸上切割DNADNA分子中的双链,但是切分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析工程中用处不大,无法用于分析DNADNA结构结构或克隆基因。这类酶如或克隆基因。这类酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。第第二二类类(II(II型型)限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序,并并在在该该顺顺序序内内的的
5、固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的。因因此此,这这种种限限制制性性内内切切酶酶是是DNADNA重重组组技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见见的的是是4 4个个或或6 6个个核核苷苷酸酸,少少数数也也有有识识别别5 5个个核核苷苷酸酸以以及及7 7个个、8 8个个、9 9个个、1010个个和和1111个个核核苷苷酸酸的的。II II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序,
6、即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴,从从这这个个轴轴朝朝二二个个方方向向“读读”都都完完全全相相同同。这这种种酶酶的的切切割可以有两种方式:割可以有两种方式:粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为:的识别顺序为:5 5 G G AATTC AATTC 3 3 3 3 C TTAA C TTAA G G 5 5从从两两侧侧“读读”核核苷苷酸酸顺顺序序都都是是GAATTCGAATTC或或CTT
7、AAGCTTAAG,这这就就是是回回文文顺顺序序(palindromepalindrome)。_ _和和表表示示在在双双链链上上交交错错切切割割的的位位置置,切切割割后后生生成成5 5G G和和AATTCAATTC3 3、3 3CTTAACTTAA和和G G5 5二二个个DNADNA片片段段,各各有有一一个个单单链链末末端端,二二条条单单链链是是互互补补的的,其其断断裂裂的的磷磷酸酸二二酯酯键键以以及及氢氢键键可可通通过过DNADNA连连接接酶酶的的作用而作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如上切割双链,产生平
8、头末端。例如EcoRVEcoRV 的识别位置是:的识别位置是:5 5 GAT GAT ATC ATC 3 33 3 CTA CTA TAG TAG 5 5 切割后形成切割后形成5 5 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、3 3 CTA CTA和和TAG TAG 5 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端:平头末端:第三类(第三类(IIIIII型型)限制性内切酶)限制性内切酶也有专一也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置
9、上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段,具有各种单链末端。因此片段,具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。不能应用于基因克隆。3)限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称,如如E.coli 用用Eco表表示,所以用斜体字。示,所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型,如如流流感感嗜嗜血血菌菌Rd菌株用菌株用d,
10、即,即Hind。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株,具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰体体,则则以以罗罗马马数数字字表表示示,如如Hind,Hind,Hind等。等。4)影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度;的纯度;(2)DNA的甲基化程度;的甲基化程度;(3)酶切消化反应的温度;酶切消化反应的温度;(4)DNA的分子结构;的分子结构;(5)溶液中离子浓度及种类;溶液中离子浓度及种类;(6)缓冲液的缓冲液的 pH值。值。实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料:实验材料:质粒质粒DNA:上周实验课提取纯化。:上周实验课提取纯化。实
11、验试剂:实验试剂:酶及其酶切缓冲液:购买成品。酶及其酶切缓冲液:购买成品。酶及其酶切缓冲液:购买成品。酶及其酶切缓冲液:购买成品。琼脂糖琼脂糖(Agarose):进口或国产的电泳用琼:进口或国产的电泳用琼脂糖均可。脂糖均可。实验仪器实验仪器恒温水浴锅恒温水浴锅反应反应 10K Buffer 2L质粒质粒DNA 16LXho I 1LBamH I 1L(2)用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液集中在管底用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液集中在管底(3)混匀反应体系后,混匀反应体系后,37水浴保温水浴保温2-3h(1)EP管编号管编号,加样加样实验步骤实验步骤反应反应 10K Buffer 2L质粒质粒
12、DNA 16LHind III 2L电泳检测示例电泳检测示例琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性,其能形成带有一定孔隙的固体基质的特性,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。可以向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素:在琼脂糖中迁移率的因素:DNA分分子的大小、子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓
13、冲液的组碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。成。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率,因此采用不同浓度的的迁移率,因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片片段。段。0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb的片段;的片段;0.5%的琼脂糖凝胶用的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的于分辨较大片段的DNA(20-100kb););对于小片段的对于小片段的DNA(0.2-2kb)可用可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。不或更高浓度的凝胶进行分离。不过,以上这些并不是绝对的,因为有过,以上这些并
14、不是绝对的,因为有时我们需要同时分离多种分子量相差时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段,因此所用琼脂糖凝胶的较大的片段,因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。浓度要视情况而定。EBEB:即:即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭苯基菲锭溴盐溴盐,(,(EthidiumEthidium Bromide)Bromide)。它能够插它能够插入入DNADNA分子中的碱基对之间而与分子中的碱基对之间而与DNADNA结合。结合。由于由于EBEB分子分子的插入,在紫外光的照射下,的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的凝胶电泳中的DNADNA条带呈现出条带呈现出红色荧光,红色
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