《工业发酵菌种选育》PPT课件.ppt
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1、 第二章工业发酵菌种来源及选育一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业对菌种的要求 微生物资源丰富,广布于土壤、水和空气等自然微生物资源丰富,广布于土壤、水和空气等自然界中,其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是界中,其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野生型,有的是通过诱变得到的突变体。野生型,有的是通过诱变得到的突变体。发展趋势:发展趋势:从野生型从野生型 变异株变异株 自然选育自然选育 代谢控制育种代谢控制育种 诱变育种诱变育种 基因工程定向育种基因工程定向育种第一节第一节 工业发酵生产菌种工业发酵生产菌种(1)所需培养基易得,价格低廉;)所需培养基易得,价格低廉;(2)培养和发酵
2、条件温和(糖浓度、温度、)培养和发酵条件温和(糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等)溶解氧、渗透压等)(3)生长速度和反应速度较快,发酵周期短)生长速度和反应速度较快,发酵周期短(4)单产高)单产高(选择(选择野生型、营养缺陷型或调节突野生型、营养缺陷型或调节突变株变株)(5)抗病毒能力强)抗病毒能力强(6)菌种纯粹,不易变异退化,稳定性好)菌种纯粹,不易变异退化,稳定性好(7)菌体不是病源菌,不产生任何有害的生物活性)菌体不是病源菌,不产生任何有害的生物活性物质和毒素(包括抗生素、激素和毒素),保证物质和毒素(包括抗生素、激素和毒素),保证安全安全微生物工业对大规模生产用菌的要求原则:微生物
3、工业对大规模生产用菌的要求原则:二、工业发酵二、工业发酵微生物及其代谢产物微生物及其代谢产物什么是初级代谢?什么是次级代谢?什么是初级代谢?什么是次级代谢?P12什么是初级代谢产物?什么是次级代谢产物?什么是初级代谢产物?什么是次级代谢产物?l初级代谢产物是指微生物产生的,生长和繁殖所必需的物初级代谢产物是指微生物产生的,生长和繁殖所必需的物质,如蛋白质、核酸等。质,如蛋白质、核酸等。l次级代谢产物是指由微生物产生的,与微生物生长、繁殖次级代谢产物是指由微生物产生的,与微生物生长、繁殖无关的一类物质。无关的一类物质。l抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物(如
4、氨基酸、核如氨基酸、核酸酸)相对产生的次级代谢产物。相对产生的次级代谢产物。1 1、微生物代谢产物的类型、微生物代谢产物的类型 2、微生物次级代谢与初级代谢的关系微生物次级代谢与初级代谢的关系l许许多多抗抗生生素素的的基基本本结结构构是是由由少少数数几几种种初初级级代代谢谢产产物物构构成成的的,所所以以次次级级代代谢谢产产物物是是以以初初级级代代谢谢产产物物为为母母体体衍衍生生出出来来的的,次次级级代代谢谢途途径径并并不不是是独独立立的的,而而是是与与初初级级代谢途径有密切关系的。代谢途径有密切关系的。l糖糖代代谢谢中中间间体体,既既可可用用来来合合成成初初级级代代谢谢产产物物,又又可可用用来
5、合成次级代谢产物,这种中间体叫做来合成次级代谢产物,这种中间体叫做分支中间体分支中间体。l微生物次级代谢,其目的产物的生物合成途径取决于微生物次级代谢,其目的产物的生物合成途径取决于微生物的微生物的培养条件和菌种的特异性培养条件和菌种的特异性。l l什么叫分叉中间体?什么叫分叉中间体?什么叫分叉中间体?什么叫分叉中间体?问题问题次生代谢产物主要在哪个时期合成?次生代次生代谢产物主要在哪个时期合成?次生代谢产物生成与初生代谢产物有关吗?谢产物生成与初生代谢产物有关吗?三、工业上常用的微生物三、工业上常用的微生物l微生物在工业上的用途很广,包括化工、医药、微生物在工业上的用途很广,包括化工、医药、
6、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。等方面。l微生物的代谢产物多,已超过微生物的代谢产物多,已超过1300多种,而用于多种,而用于大规模工业生产的不足大规模工业生产的不足100多种;微生物酶有近千多种;微生物酶有近千种,而工业上用的不过种,而工业上用的不过4050种。微生物具有巨种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。大的潜力可挖掘。l工业上常用菌种:工业上常用菌种:细菌、放线菌、酵母菌、霉菌细菌、放线菌、酵母菌、霉菌 1、常用的细菌、常用的细菌 大肠杆菌大肠杆菌 应用:对谷氨酸定量应用:对谷氨酸定量分析,生产天冬氨分析,生产天冬氨酸、苏氨酸、缬
7、氨酸、苏氨酸、缬氨酸。酸。乳酸杆菌乳酸杆菌应用:乳酸、干应用:乳酸、干酪、奶子酒、发酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶面、泡菜、酸奶等的制作等的制作l枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌l应用:生产淀粉酶、应用:生产淀粉酶、蛋白酶等蛋白酶等2、酵母菌、酵母菌种类:种类:酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母 应用:生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡应用:生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪和制取蛋白质、生产脂肪面包酵母面包酵母啤酒酵啤酒酵母母红酵红酵母母3、霉菌、霉菌l曲霉属曲霉属l应用:生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄应用
8、:生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶糖氧化酶l应用:酱油、酱类(淀粉酶)应用:酱油、酱类(淀粉酶)l米曲霉米曲霉l应用:产糖化酶和蛋白酶、应用:产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制主要用于酿酒制曲和酱油制曲曲应用:生产甲义丁二酸应用:生产甲义丁二酸 毛毛 霉霉l应用:可以产生蛋白酶,我国多应用:可以产生蛋白酶,我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作用于豆腐乳、豆豉等的制作l根霉根霉l种类:米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉种类:米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉l应用:酿酒应用:酿酒青霉菌青霉菌应用:生产青霉素、葡萄糖氧应用:生产青霉素、葡萄糖氧化酶化酶4、放线菌、放线菌气气生生菌菌丝
9、丝孢孢子子丝丝孢子孢子基内菌丝基内菌丝培养基培养基种类:龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉种类:龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌菌、红霉素链霉菌应用:各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、应用:各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素红霉素第二节、生产菌种的选育第二节、生产菌种的选育 二、菌种选二、菌种选育方法育方法诱变育种诱变育种代谢调控育种代谢调控育种自然选自然选育育基因定向育种:基因工程,杂基因定向育种:基因工程,杂交,细胞工程交,细胞工程(原生质体融合)原生质体融合)一、选育的目的一、选育的目的 改善菌种的特性,使产量提高,改进质量、降低改善菌种的特性,使产量提高,改
10、进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。采样采样 预处理预处理 富集培养富集培养 菌种初筛菌种初筛 菌种复筛菌种复筛 性能鉴定性能鉴定 菌种保藏菌种保藏 (P14)如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的:目的:高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题:三、自然选育的基本过程三、自然选育的基本过程(一)采样(一)采样l1、采样对象、采样对象 以以采采集集土土壤壤为为主主。一一般般园园田田土土和和耕耕作作过过的的沼沼泽
11、泽土土中中,以以细细菌菌和和放放线线菌菌为为主主,富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中,酵酵母母和和霉霉菌菌较较多多,如如一一些些野野果果生生长长区区和和果果园园内内。采采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。l2、根据微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境取样、根据微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境取样l 如如产产纤纤维维素素酶酶菌菌、产产壳壳聚聚糖糖酶酶菌菌、产产蛋蛋白白酶酶菌菌或或脂脂肪肪酶菌、产淀粉酶菌或糖化酶菌、极端微生物等。酶菌、产淀粉酶菌或糖化酶菌、极端微生物等。l3、采采土土方方式式:在在选选好好适适
12、当当地地点点后后,用用小小萨萨子子除除去去表表土土,取取离离地地面面5-25cm处处的的土土约约10-25g,盛盛入入无无菌菌的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中,扎扎好好,标标记记,记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件等,以备查考。件等,以备查考。(二)富集培养(二)富集培养l富集培养:人为地增加分离概率,增加该菌种的数量,富集培养:人为地增加分离概率,增加该菌种的数量,使使目的微生物在种群中占优势目的微生物在种群中占优势。l方法:控制一定的养分(碳源或氮源);控制一定的培养方法:控制一定的养分(碳源或氮源);控制一定的培养条件(温度、条件(温度、pH、底物等)。、底物等)
13、。(三)培养分离(三)培养分离l 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著,但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离,纯纯化化。在在这这一一步步,增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用,而而且且控控制制得得细细一一点点,好好一一点点。纯纯种种分分离离的的方方法法有有划划线线分分离离法法、稀释分离法、组织分离法。稀释分离法、组织分离法。培养条件控制培养条件控制l营养成分控制、控制培养基的营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、添加抑制剂、热处理、控制培养温度、控制通气量控制培养温度、控制通
14、气量1、如何控制营养成分,分离自养型微生物、固氮菌、纤、如何控制营养成分,分离自养型微生物、固氮菌、纤维素酶菌、几丁质酶菌?维素酶菌、几丁质酶菌?2、如何控制培养基、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉?分离产柠檬酸的黑曲霉?3、分离放线菌、细菌、霉菌时,选择哪些抑制剂?、分离放线菌、细菌、霉菌时,选择哪些抑制剂?4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么?厌氧培养、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么?厌氧培养中加入焦性没食子酸与中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么?的作用是什么?5、如何分离芽孢菌?、如何分离芽孢菌?问题?问题?实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)实例:
15、碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目)采样(造纸厂)采样(造纸厂)80处理处理30分钟分钟文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌,产生菌为中性牙孢杆菌,嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC(羧甲基纤维素),(羧甲基纤维素),pH10.5培养培养34天,选择有凹陷圈的菌落天,选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型(四)筛(四)筛 选(生产能力的考察)选(生产能力的考察)l 初筛初筛:平板筛选法和摇瓶发酵筛选法。:平板筛选法和摇瓶发酵筛选法。l复复筛筛:采采用用与与生生产产相
16、相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件,通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验,以以求求得得适适合合于于工工业业生生产用菌种。产用菌种。(五)毒性试验(五)毒性试验l 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的,将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心,尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种,更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定,微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外,其其他他微微生生
17、物物作作为为食食用用,均均需需通通过过两年以上的毒性试验。两年以上的毒性试验。(六)微生物选择性分离的原理和方法(六)微生物选择性分离的原理和方法l施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法l1、控制营养和培养条件以利于待分离菌株的生长和抑制、控制营养和培养条件以利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长;非目的微生物的生长;l2、根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化、根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择性培养基,通过观察微生物在选择培养基反应来设计选择性培养基,通过观察微生物在选择培养基上生长状况或生化反应进行分离。上生长状况或生化反应进行分离。(3)抗生素
18、或试剂;()抗生素或试剂;(P32)施加选择性压力分离法;施加选择性压力分离法;(1)环境条件:温度、)环境条件:温度、pH、渗透压、氧气等;、渗透压、氧气等;(2)碳源、氮源(培养基);()碳源、氮源(培养基);(P32)(4)培养方法:分批式富集培养(摇瓶培养),恒化式)培养方法:分批式富集培养(摇瓶培养),恒化式 富集富集 培养(连续培养)(培养(连续培养)(P34)酪素培养基和淀粉培养基酪素培养基和淀粉培养基l变色圈法:如果胶酶产生菌、谷氨酸生产菌等;变色圈法:如果胶酶产生菌、谷氨酸生产菌等;l透明圈法:如淀粉酶生产菌、纤维素酶生产菌等;透明圈法:如淀粉酶生产菌、纤维素酶生产菌等;l生
19、长圈法:工具菌是营养缺陷型菌株。生长圈法:工具菌是营养缺陷型菌株。l抑菌圈法:工具菌一般是抗生素敏感菌。抑菌圈法:工具菌一般是抗生素敏感菌。拮抗菌对青枯病菌的抑制拮抗菌对青枯病菌的抑制 拮抗菌对白绢小菌核菌的抑制拮抗菌对白绢小菌核菌的抑制 随机分离法随机分离法(生物活性物质产生菌的分离)生物活性物质产生菌的分离)P19-21l抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离 高灵敏度的试验菌高灵敏度的试验菌l抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离 生化诱导分析法和生化诱导分析法和SOS生色检生色检测法测法 l酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离 选择与生理性或病理性相关酶选择与生理性或病理性相关
20、酶l抗病毒药物产生菌的分离抗病毒药物产生菌的分离l生长因子产生菌的分离生长因子产生菌的分离 营养缺陷型菌株为试验菌营养缺陷型菌株为试验菌l免疫激活剂产生菌的分离免疫激活剂产生菌的分离 抑制细胞表面酶抑制细胞表面酶l多糖产生菌的分离多糖产生菌的分离 菌落较黏稠菌落较黏稠2.工业菌种育种的手段:工业菌种育种的手段:自然选育(自然选育(P36)诱变育种(诱变育种(P3741)杂交育种(杂交育种(P4348)原生质体融合(原生质体融合(P48)基因工程育种(基因工程育种(P58)四、诱变育种四、诱变育种l诱变育种的概念诱变育种的概念l以以微微生生物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选
21、种种的的机机率率并并不不很很高高,一个基因的自然突变频率仅一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。左右。l以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种,是是迄迄今今为为止止国国内内外外提提高高菌菌种种产产量、性能的主要手段。量、性能的主要手段。l诱变育种包括诱变和筛选两个部分。诱变育种包括诱变和筛选两个部分。l诱诱变变成成功功的的关关键键包包括括出出发发菌菌株株的的选选择择、诱诱变变剂剂种种类类和和剂剂量量的选择。的选择。1 1、诱变剂和诱变处理、诱变剂和诱变处理l 物物理理诱诱变变剂剂:射射线线如如紫紫外外线线、X射射线线、射射线线,快快中子;中子;紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧
22、啶二聚体以改变紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体死亡和变异。生物活性,造成菌体死亡和变异。化学诱变剂:化学诱变剂:化学因子如碱基类似物、化学因子如碱基类似物、55氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点:使用化学诱变剂的优缺点:就突变数量而言,要比电离辐射更有效。就突变数量而言,要比电离辐射更有效。选用最适剂量,选用最适剂量,充分利用复合处理的协同效应。充分利用复合处理的协同效应。MutationVia chemicalor physical,and biol
23、ogicalmeans2 2、诱变剂的选择、诱变剂的选择1 1)碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有很很高高的的特特异异性性,但但很很少少使使用用,回回复突变率高,效果不大。复突变率高,效果不大。2 2)亚亚硝硝酸酸和和烷烷化化剂剂应应用用的的范范围围较较广广,造造成成的的遗遗传传损损伤伤较较多多。其其中中亚亚硝硝基基胍胍和和甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯常常被被称称为为“超超诱诱变变剂剂”,甲甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3 3)吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。)吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4 4)紫紫外外线线仍仍十十分分有有
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