《实时荧光定量》PPT课件.ppt
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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR(Real time Quantitative PCR)专专 业:业:生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学 姓姓 名:名:王梦圆王梦圆 学学 号号:2013211026 1、定义、定义 2、概念和原理、概念和原理 3、染料、染料 定义定义 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的局限性电泳分析方法的局限性只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事无法对扩增反应实时
2、监测实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质主要亮点主要亮点 实时实时 定量定量怎样实现实时定量?这是应为在PCR反应体系中加入了荧光基团,利用荧光信号的积累实现实时
3、监测整个PCR进程,借助RT-PCR仪绘制出的曲线对起始模板进行定量分析。借助荧光物质示踪扩增产物量的变化。RT-PCR中重要概念和原理扩增曲线:扩增曲线:荧光扩增曲线可以分成四个阶段:荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段 荧光信号线性扩增阶段 平台期重要概念和定量原理扩增曲线:基线基线:在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。荧光阈值:荧光阈值:荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置在 3-15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍。Cycle(循环数)(循环数)Rn(
4、荧光强度(荧光强度)Baseline1荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值荧光阈值平台期平台期Lgliner phaseCT值:值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值(threshold value)Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)Ct value Ct值值浓度低浓度低浓度低浓度低浓度高浓度高浓度高浓度高起始模板差10倍,Ct值差3.3。CTCT值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度
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