免疫细胞化学实验技能总结课件.ppt
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1、关于免疫细胞化学实验技能总关于免疫细胞化学实验技能总结结现在学习的是第1页,共78页1 1 1 1 1 1、定义、定义、定义、定义、定义、定义用用用用标标标标记记记记的的的的特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体对对对对组组组组织织织织切切切切片片片片或或或或细细细细胞胞胞胞标标标标本本本本中中中中某某某某些些些些化化化化学学学学成成成成分分分分的的的的分分分分布布布布和和和和含含含含量量量量进进进进进进行行行行行行组组组组组组织织织织织织和和和和和和细细细细细细胞胞胞胞胞胞原原原原原原位位位位位位定定定定定定性性性性性性、定定定定定定位位位位位位或或或或或或 定定定定定定 量量量量量量 研
2、研研研研研 究究究究究究,这这这这这这 种种种种种种 技技技技技技 术术术术术术 称称称称称称 为为为为为为免免免免 疫疫疫疫 组组组组 织织织织 化化化化 学学学学(immunohistochemistryimmunohistochemistryimmunohistochemistryimmunohistochemistry)技技技技技技 术术术术术术 或或或或或或 免免免免免免 疫疫疫疫疫疫 细细细细细细 胞胞胞胞胞胞 化化化化化化 学学学学学学(immunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemistryimmunocytochemi
3、stryimmunocytochemistryimmunocytochemistry)技术。)技术。)技术。)技术。现在学习的是第2页,共78页2 2 2 2、原理、原理、原理、原理根根根根根根据据据据据据抗抗抗抗抗抗原原原原原原抗抗抗抗抗抗体体体体体体反反反反反反应应应应应应和和和和化化化化学学学学显显显显色色色色原原原原理理理理,组组组组组组织织织织织织切切切切切切片片片片片片或或或或或或细细细细细细胞胞胞胞胞胞标标标标标标本本本本本本中中中中中中的的的的的的抗抗抗抗抗抗原原原原原原先先先先先先和和和和和和一一一一一一抗抗抗抗抗抗结结结结结结合合合合合合,再再再再再再利利利利利利用用用用用
4、用一一一一一一抗抗抗抗抗抗与与与与与与标标标标标标记记记记记记生生生生生生物物物物物物素素素素素素、荧荧荧荧荧荧光光光光光光素素素素素素等等等等等等的的的的的的二二二二二二抗抗抗抗抗抗进进进进进进行行行行行行反反反反反反应应应应应应,最最最最最最后后后后后后通通通通通通过过过过过过呈呈呈呈呈呈色色色色色色反反反反反反应应应应应应或或或或或或荧荧荧荧荧荧光光光光光光来来来来来来显显显显显显示示示示示示细细细细细细胞胞胞胞胞胞或或或或或或组组组组组组织织织织织织中中中中中中化化化化化化学学学学学学成成成成成成分分分分分分,在在在在在在光光光光光光学学学学学学显显显显显显微微微微微微镜镜镜镜镜镜或或
5、或或或或荧荧荧荧荧荧光光光光光光显显显显显显微微微微微微镜镜镜镜镜镜下下下下下下可可可可可可清清清清清清晰晰晰晰晰晰看看看看看看见见见见见见细细细细细细胞胞胞胞胞胞内内内内内内发发发发发发生生生生生生的的的的的的抗抗抗抗抗抗原原原原原原抗抗抗抗抗抗体体体体体体反反反反反反应应应应应应产产产产产产物物物物物物,从从从从从从而而而而而而能能能能能能够够够够够够在在在在在在细细细细细细胞胞胞胞胞胞爬爬爬爬爬爬片片片片片片或或或或组织切片组织切片组织切片组织切片组织切片组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。上原位确定某些化学成分的分布和含量。上原位确定某些化学成分的分布和含量。上原位确定某些化学
6、成分的分布和含量。现在学习的是第3页,共78页常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有荧光素荧光素荧光素荧光素荧光素荧光素、酶酶酶酶酶酶和和和和和和放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素:标标标标标标记记记记记记荧荧荧荧荧荧光光光光光光素素素素素素的的的的的的称称称称称称为为为为为为免免免免免免疫疫疫疫疫疫荧荧荧荧荧荧光光光光光光法法法法法法,常常常常常常用用用用用用的的的的的的荧荧荧荧荧荧光光光光光光素素素素素素有有有有有有异异异异异异硫硫硫硫硫硫氰氰氰氰氰氰酸酸酸酸酸酸荧荧荧荧荧荧光光光光光光素素素素素素(FIT
7、C)(FITC)(FITC)、罗丹明、罗丹明、罗丹明、罗丹明、罗丹明、罗丹明(rhodamine)(rhodamine)(rhodamine)等。等。等。等。等。等。标标标标标标 记记记记记记 酶酶酶酶酶酶 的的的的的的 称称称称称称 为为为为为为 免免免免免免 疫疫疫疫疫疫 酶酶酶酶酶酶 法法法法法法,常常常常常常 用用用用用用 的的的的的的 酶酶酶酶酶酶 有有有有有有 辣辣辣辣辣辣 根根根根根根 过过过过过过 氧氧氧氧氧氧 化化化化化化 物物物物物物 酶酶酶酶酶酶(horseradish peroxidase)(horseradish peroxidase)(horseradish per
8、oxidase)等。等。等。等。等。等。标标标标标标记记记记记记同同同同同同位位位位位位素素素素素素的的的的的的称称称称称称为为为为为为放放放放放放射射射射射射免免免免免免疫疫疫疫疫疫法法法法法法,常常常常常常用用用用用用的的的的的的同同同同同同位位位位位位素素素素素素有有有有有有3 33H HH、141414C CC、323232S S S和和和和和和313131P P P等。等。等。等。等。等。现在学习的是第4页,共78页 二、免疫酶二、免疫酶/免疫荧光免疫荧光三、酶联免疫吸附试验三、酶联免疫吸附试验一、石蜡切片一、石蜡切片/冰冻切片冰冻切片讲解提纲讲解提纲现在学习的是第5页,共78页(1
9、)石蜡切片的制作石蜡切片的制作石蜡切片的制作石蜡切片的制作 蒸馏水洗涤蒸馏水洗涤蒸馏水洗涤蒸馏水洗涤2 2遍遍遍遍二甲苯约二甲苯约二甲苯约二甲苯约20min20min、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯/石蜡石蜡石蜡石蜡(1:1)30min,(1:1)30min,纯蜡纯蜡纯蜡纯蜡、各各各各30min30min常规石蜡切片,切片厚度为常规石蜡切片,切片厚度为常规石蜡切片,切片厚度为常规石蜡切片,切片厚度为7 m7 m5050、7070 、8080酒酒酒酒精精精精各各各各15 15 min min,9595酒酒酒酒精精精精、各各各各15 15 minmin,无无无无水水水水乙乙乙乙醇醇醇醇 、各各各各
10、15 15 minmin,无无无无水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇/二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯(1:1)15 min(1:1)15 min于干净载玻片上进行展片,于干净载玻片上进行展片,于干净载玻片上进行展片,于干净载玻片上进行展片,3737烤干烤干烤干烤干取材、固定取材、固定取材、固定取材、固定酒精脱水酒精脱水酒精脱水酒精脱水洗涤洗涤洗涤洗涤展片、烤片展片、烤片展片、烤片展片、烤片包埋、切片包埋、切片包埋、切片包埋、切片透明、浸蜡透明、浸蜡透明、浸蜡透明、浸蜡现在学习的是第6页,共78页n n根据不同的实验目的,选择相应的材料,材料要求根据不同的实验目的,选择相应的材料,材料要求根据不同的实验目的,选
11、择相应的材料,材料要求根据不同的实验目的,选择相应的材料,材料要求新新鲜鲜、准确准确准确准确、完整完整,材料要避免,材料要避免挤压挤压、挫伤挫伤、干枯干枯。n n所采集材料应所采集材料应所采集材料应所采集材料应立即立即放入固定液,并编号,注明采集时间、放入固定液,并编号,注明采集时间、放入固定液,并编号,注明采集时间、放入固定液,并编号,注明采集时间、名称、组织部位,所取组织块要名称、组织部位,所取组织块要名称、组织部位,所取组织块要名称、组织部位,所取组织块要大小适当大小适当,即要能说明,即要能说明,即要能说明,即要能说明问题,又要考虑固定剂的穿透能力。问题,又要考虑固定剂的穿透能力。问题,
12、又要考虑固定剂的穿透能力。问题,又要考虑固定剂的穿透能力。n n如:角膜、如:角膜、TE-HCTE-HC等组织材料等组织材料 细胞材料细胞材料细胞材料细胞材料 肝脏、鱼卵肝脏、鱼卵 取材取材现在学习的是第7页,共78页 取材后,应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个取材后,应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个取材后,应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个取材后,应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个步骤,制片质量的优劣除与材料的新鲜程度有关外,还取步骤,制片质量的优劣除与材料的新鲜程度有关外,还取步骤,制片质量的优劣除与材料的新鲜程度有关外,还取步骤,制片质量的优劣除与材料的新鲜程度
13、有关外,还取决于最初的固定是否适当和完全。决于最初的固定是否适当和完全。决于最初的固定是否适当和完全。决于最初的固定是否适当和完全。n n固定的意义固定的意义 新鲜的组织被割取后新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖,可引起组织的繁殖,可引起组织的自溶和腐败自溶和腐败。因此,割取组织块。因此,割取组织块后,应立即采用一种方法将组织尽可能保持原有的后,应立即采用一种方法将组织尽可能保持原有的形态结构,且有利于保存和适于制片的操作,这一步形态结构,且有利于保存和适于制片的操作,这一步骤称为骤称为固定固定固定固定。固定固定现在学习的是第8页,共78页固定的目的和
14、作用在于:固定的目的和作用在于:防止组织自溶和腐败;防止组织自溶和腐败;防止组织自溶和腐败;防止组织自溶和腐败;使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构;近似的形态和结构;因沉淀及凝固的关系,使细胞内不同的成分产生不同的因沉淀及凝固的关系,使细胞内不同的成分产生不同的因沉淀及凝固的关系,使细胞内不同的成分产生不同的因沉淀及凝固的关系,使细胞内不同的成分产生不同的折光率,造成光学上的差别,使原来在生活情况下看不折光率,造成光学上的差别,使
15、原来在生活情况下看不折光率,造成光学上的差别,使原来在生活情况下看不折光率,造成光学上的差别,使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见,且有的固定剂还有助染作用清楚的结构变得清晰易见,且有的固定剂还有助染作用清楚的结构变得清晰易见,且有的固定剂还有助染作用清楚的结构变得清晰易见,且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸如醋酸、苦味酸),从而使细胞各部易于染色;,从而使细胞各部易于染色;固定剂还兼有硬化作用,使柔软组织硬化而不易变形,有固定剂还兼有硬化作用,使柔软组织硬化而不易变形,有固定剂还兼有硬化作用,使柔软组织硬化而不易变形,有固定剂还兼有硬化作用,使柔软组织硬化而不易变形,有利于操作
16、。利于操作。利于操作。利于操作。现在学习的是第9页,共78页名称名称名称名称10%10%10%10%甲醛甲醛甲醛甲醛4%4%4%4%多聚多聚多聚多聚甲醛甲醛甲醛甲醛苦味酸苦味酸苦味酸苦味酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸锇酸锇酸锇酸锇酸固定效果固定效果固定效果固定效果好好好好好好好好沉淀一切沉淀一切沉淀一切沉淀一切蛋白蛋白蛋白蛋白对染色质对染色质对染色质对染色质固定好固定好固定好固定好好好好好组织收缩组织收缩组织收缩组织收缩大大大大小小小小大大大大小小小小小小小小主要用途主要用途主要用途主要用途常规病理常规病理常规病理常规病理切片切片切片切片免疫化学免疫化学免疫化学免疫化学 不单独使不单独使不单独使不
17、单独使用用用用不单独使不单独使不单独使不单独使用用用用-核核核核型型型型电镜电镜电镜电镜缺缺缺缺 点点点点长期用其长期用其长期用其长期用其固定的组固定的组固定的组固定的组织变为酸织变为酸织变为酸织变为酸性不利于性不利于性不利于性不利于染色,特染色,特染色,特染色,特别是细胞别是细胞别是细胞别是细胞核的着色核的着色核的着色核的着色固定的时固定的时固定的时固定的时间不宜太间不宜太间不宜太间不宜太长,以长,以长,以长,以24242424小时小时小时小时以内为宜以内为宜以内为宜以内为宜渗透力弱,渗透力弱,渗透力弱,渗透力弱,对组织收对组织收对组织收对组织收缩大缩大缩大缩大使组织膨使组织膨使组织膨使组织
18、膨胀,一般胀,一般胀,一般胀,一般不单独使不单独使不单独使不单独使用用用用价格昂贵;价格昂贵;价格昂贵;价格昂贵;有毒有毒有毒有毒现在学习的是第10页,共78页混合固定剂混合固定剂混合固定剂混合固定剂(1 1 1 1)BouinBouinBouinBouin氏固定液氏固定液氏固定液氏固定液:为常用的良好的固定剂,穿透速度快,组织收:为常用的良好的固定剂,穿透速度快,组织收:为常用的良好的固定剂,穿透速度快,组织收:为常用的良好的固定剂,穿透速度快,组织收缩性较小,固定均匀,固定后组织有适当的硬度,缩性较小,固定均匀,固定后组织有适当的硬度,缩性较小,固定均匀,固定后组织有适当的硬度,缩性较小,
19、固定均匀,固定后组织有适当的硬度,对于切片和染色对于切片和染色对于切片和染色对于切片和染色均有良好的效果均有良好的效果均有良好的效果均有良好的效果。一般固定。一般固定。一般固定。一般固定1224122412241224小时,固定后入小时,固定后入小时,固定后入小时,固定后入70%70%70%70%酒精洗去酒精洗去酒精洗去酒精洗去苦味酸的黄色,在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色。苦味酸的黄色,在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色。苦味酸的黄色,在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色。苦味酸的黄色,在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色。(2 2 2 2)CarnoyCarnoyCarnoyCarnoy液液液液:渗
20、透力强,特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液:渗透力强,特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液:渗透力强,特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液:渗透力强,特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示等一些较为细微的结构。显示等一些较为细微的结构。显示等一些较为细微的结构。显示DNADNADNADNA、RNARNARNARNA效果良好。效果良好。效果良好。效果良好。(3 3 3 3)改良改良改良改良BouinBouinBouinBouin氏固定液氏固定液氏固定液氏固定液:此液对一般组织固定效果都很好,固:此液对一般组织固定效果都很好,固:此液对一般组织固定效果都很好,固:此液对一般组织固定效果都
21、很好,固定时间为定时间为定时间为定时间为418418418418小时,固定后直接放小时,固定后直接放小时,固定后直接放小时,固定后直接放70%70%70%70%乙醇脱水,固定时间较长乙醇脱水,固定时间较长乙醇脱水,固定时间较长乙醇脱水,固定时间较长对组织亦无损害。对组织亦无损害。对组织亦无损害。对组织亦无损害。现在学习的是第11页,共78页固定时应注意的事项固定时应注意的事项(1 1 1 1)固定液及被固定的组织必须)固定液及被固定的组织必须)固定液及被固定的组织必须)固定液及被固定的组织必须新鲜新鲜新鲜新鲜;(2 2 2 2)固定液的用量一般为组织体积的)固定液的用量一般为组织体积的)固定液
22、的用量一般为组织体积的)固定液的用量一般为组织体积的1020102010201020倍,容器不要过倍,容器不要过倍,容器不要过倍,容器不要过小,材料也不要太多;应避免组织紧贴瓶底或瓶壁,以免影小,材料也不要太多;应避免组织紧贴瓶底或瓶壁,以免影小,材料也不要太多;应避免组织紧贴瓶底或瓶壁,以免影小,材料也不要太多;应避免组织紧贴瓶底或瓶壁,以免影响固定液的渗入;响固定液的渗入;响固定液的渗入;响固定液的渗入;(3 3 3 3)固定时间视)固定时间视)固定时间视)固定时间视组织块的种类、性质、大小,固定液的种类、性质、组织块的种类、性质、大小,固定液的种类、性质、组织块的种类、性质、大小,固定液
23、的种类、性质、组织块的种类、性质、大小,固定液的种类、性质、渗透力的强弱,固定时的温度的高低,实验目的渗透力的强弱,固定时的温度的高低,实验目的渗透力的强弱,固定时的温度的高低,实验目的渗透力的强弱,固定时的温度的高低,实验目的等;等;等;等;(4 4 4 4)固定所用的固定液,以)固定所用的固定液,以)固定所用的固定液,以)固定所用的固定液,以新配新配新配新配的为好,放置过久会失效;的为好,放置过久会失效;的为好,放置过久会失效;的为好,放置过久会失效;(5 5 5 5)在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入,)在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入,)在固定期间摇动组织或摇
24、动容器有利于固定液的渗入,)在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入,对长期固定的标本,可对长期固定的标本,可对长期固定的标本,可对长期固定的标本,可经常更换固定液经常更换固定液经常更换固定液经常更换固定液;(6 6 6 6)取材固定应同时)取材固定应同时)取材固定应同时)取材固定应同时作好记录作好记录作好记录作好记录,包括组织名称、固定液和时,包括组织名称、固定液和时,包括组织名称、固定液和时,包括组织名称、固定液和时间等内容。间等内容。间等内容。间等内容。现在学习的是第12页,共78页乙醇:乙醇:乙醇:乙醇:高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点,因高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆
25、化的缺点,因高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点,因高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点,因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过由由由由低到高低到高低到高低到高的一系列不同浓度的酒精,逐渐取代组织中水的一系列不同浓度的酒精,逐渐取代组织中水分,以保证组织脱水彻底,并避免组织过度收缩和硬分,以保证组织脱水彻底,并避免组织过度收缩和硬化。化。脱水脱水现在学习的是第13页,共78页注意事项:注意事项:(1 1 1 1)脱水的时间应根据)脱水的时间
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