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1、酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术第1页,此课件共72页哦第四节第四节酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术 第2页,此课件共72页哦体液中酶的测定是临床生物化学检验的一项重要内容。体液中酶的测定是临床生物化学检验的一项重要内容。二十世纪二十世纪50年代人们用分光光度法建立了连续监测酶年代人们用分光光度法建立了连续监测酶活性浓度方法,到活性浓度方法,到60年代特别是年代特别是80年代以后,由于各种年代以后,由于各种工具酶和酶分析试剂盒的生产与普及,自动和半自动生物工具酶和酶分析试剂盒的生产与普及,自动和半自动生物化学分析仪的引进和应用,使得各种体液酶的测定在方法化学分析仪的引进和应用,
2、使得各种体液酶的测定在方法学与临床应用方面有了长足的进步与发展。学与临床应用方面有了长足的进步与发展。第3页,此课件共72页哦一、概一、概 述述正常人血中大部分酶一般在正常人血中大部分酶一般在pg(10-12克)到克)到ng(10-9克)克)水平,要直接测定这种微量酶蛋白是十分困难的。水平,要直接测定这种微量酶蛋白是十分困难的。常用的酶学测定方法则利用酶有加速化学反应(催化)的常用的酶学测定方法则利用酶有加速化学反应(催化)的特性,通过测定被加速化学反应的反应速率,根据酶促反特性,通过测定被加速化学反应的反应速率,根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量来计算酶活性浓度的高应中底物的减少量或产
3、物的生成量来计算酶活性浓度的高低。这种低。这种 浓度的浓度的确切名称确切名称是是“酶的催化活性浓酶的催化活性浓度度”或或简称简称为为“酶活性浓度酶活性浓度”。第4页,此课件共72页哦按监测方法分类可分为量气法、分光光度按监测方法分类可分为量气法、分光光度法、荧光法和放射性核素法、电极法和其法、荧光法和放射性核素法、电极法和其他方法。他方法。以分光光度法最为以分光光度法最为常用常用。第5页,此课件共72页哦1量气法量气法 测定原理是通过测量一封闭反应系统中气体测定原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力,从而计算出气体的变化量。变化后的气体体积或压力,从而计算出气体的变化量。适用
4、于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶,如氧适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶,如氧化酶反应涉及氧气的消耗,脱羧酶会产生二氧化碳等。化酶反应涉及氧气的消耗,脱羧酶会产生二氧化碳等。此法操作烦琐,灵敏度低且技术要求高,临床实验室很少此法操作烦琐,灵敏度低且技术要求高,临床实验室很少采用。采用。第6页,此课件共72页哦2分光光度法分光光度法 从从50年代起采用分光光度法取代比色年代起采用分光光度法取代比色法,其最大优点在于扩大了测定范围,波长范围更法,其最大优点在于扩大了测定范围,波长范围更宽。酶促反应的底物与产物结构不同,光吸收谱也宽。酶促反应的底物与产物结构不同,光吸收谱也有差异,不仅能在
5、可见光范围测定有色溶液的浓度,有差异,不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度,还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质。结构的无色物质。第7页,此课件共72页哦结合各种工具酶的偶联反应,如应用结合各种工具酶的偶联反应,如应用NAD(P)H和和NAD(P)吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法,使分光光度法得到了进一步发展,几乎可应用于的方法,使分光光度法得到了进一步发展,几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂
6、盒的普及应用,这一方法在临床酶学测定中起着十用试剂盒的普及应用,这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。分重要的作用。第8页,此课件共72页哦3荧光法和放射性核素法荧光法和放射性核素法 对于一些酶浓度对于一些酶浓度很低的标本,用普通的分光光度法往往测很低的标本,用普通的分光光度法往往测不出来,此时可考虑改用灵敏度较高的荧不出来,此时可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。光法或放射性核素法。第9页,此课件共72页哦荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率,此速荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率,此速率与酶浓度成正比,并通过荧光光度计进行测定,率与酶浓度成正比,并通过荧光光度计进行测定
7、,根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如,还原根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如,还原型的型的NAD(P)H有强烈的荧光,故所有以有强烈的荧光,故所有以NAD(P)为为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂,目前应用较少。核素法因有污染且操作烦杂,目前应用较少。第10页,此课件共72页哦4其他方法其他方法 当酶促反应涉及酸碱变化时,当酶促反应涉及酸碱变化时,可用可用pH仪或电位滴定仪测定酸碱度变化来仪或电位滴定仪测定酸碱度变化来计算酶浓度。这类方法需要一定仪器,操计算酶浓度。这类方法需要一定仪器,操作麻烦。此外,各种电极法、
8、旋光法、极作麻烦。此外,各种电极法、旋光法、极谱法、高效液相色谱法或生物发光法等也谱法、高效液相色谱法或生物发光法等也可用于测定特定的酶或进行酶学研究。可用于测定特定的酶或进行酶学研究。第11页,此课件共72页哦Note极谱法(极谱法(polarography)通过测定电解过程中所得到的极化电极通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流的电流-电位(或电位电位(或电位-时间)曲线来确定溶时间)曲线来确定溶液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。第12页,此课件共72页哦二、酶活性浓度测定方法二、酶活性浓度测定方法测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最测定酶的催化
9、活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法,具有迅速、灵敏、成本低为常用的方法,具有迅速、灵敏、成本低等特点。等特点。可根据酶促反应进程曲线,采用合理的方可根据酶促反应进程曲线,采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。法进行酶活性浓度的测定。第13页,此课件共72页哦(一)酶促反应进程(一)酶促反应进程如将酶促反应过程中测得的产物如将酶促反应过程中测得的产物 P 或底物或底物 S 变化量对时间作图,可得酶促反应时间变化量对时间作图,可得酶促反应时间进程曲线(图进程曲线(图6-2)。图中产物)。图中产物 P 或底物或底物 S 变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。第14页
10、,此课件共72页哦第15页,此课件共72页哦大多数酶促反应进程曲线表明,在酶促反大多数酶促反应进程曲线表明,在酶促反应一开始的阶段,底物应一开始的阶段,底物 S 浓度不断下降,浓度不断下降,随之有相应产物随之有相应产物 P 产生。但由于各种因素产生。但由于各种因素的影响,反应速率比较慢,这段时间称为的影响,反应速率比较慢,这段时间称为延滞期(延滞期(1ag phase),可以是几秒至几分),可以是几秒至几分钟。尤其是双底物反应或需要辅酶参与者,钟。尤其是双底物反应或需要辅酶参与者,通常为通常为13min。第16页,此课件共72页哦随后在过量的底物存在下,反应速率加快随后在过量的底物存在下,反应
11、速率加快并达到一个反应速率稳定的阶段,即酶促并达到一个反应速率稳定的阶段,即酶促反应以恒定的速率进行,不受底物浓度的反应以恒定的速率进行,不受底物浓度的影响,这段反应称为线性反应期(影响,这段反应称为线性反应期(1inear phase)或)或零级反应期零级反应期(zero order)。产物)。产物 P 和底物和底物 S 与时间与时间t成线性关系。成线性关系。第17页,此课件共72页哦随着时间的延长,由于种种因素,如底物随着时间的延长,由于种种因素,如底物因酶反应消耗而浓度下降,产物浓度上升因酶反应消耗而浓度下降,产物浓度上升出现逆反应,反应产物可能有抑制酶反应出现逆反应,反应产物可能有抑制
12、酶反应作用或酶的热失活等,使酶促反应变慢,作用或酶的热失活等,使酶促反应变慢,即反应速率下降,偏离线性,这段时间称即反应速率下降,偏离线性,这段时间称为为一级反应期一级反应期(first order)。)。第18页,此课件共72页哦反应速率与底物反应速率与底物 S 成正比,产物成正比,产物P 与时与时间间t不成线性关系。如果反应速率受两种或不成线性关系。如果反应速率受两种或两种以上物质浓度的影响,则反应可为一两种以上物质浓度的影响,则反应可为一级、二级或多级反应,一般将这段反应时级、二级或多级反应,一般将这段反应时间统称为非线性反应期。图间统称为非线性反应期。图6-3显示单试剂显示单试剂速率法
13、酶促反应进程曲线。速率法酶促反应进程曲线。第19页,此课件共72页哦第20页,此课件共72页哦为了计算酶活性浓度,必须根据线性反应为了计算酶活性浓度,必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度,期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度,否则将导致误差。在延滞期、非线性反应否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果不准确,一般结果偏低。期所测得的结果不准确,一般结果偏低。第21页,此课件共72页哦(二)酶活性浓度测定方法(二)酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(度(v)达到最大速度)达到最大速度Vmax,即在过量底物,即在过
14、量底物存在下的零级反应期的速度,此时反应速存在下的零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度度与酶浓度 E 之间有线性关系。之间有线性关系。第22页,此课件共72页哦如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类,可分为定时法(分类,可分为定时法(fixed time assay)和)和连续监测法(连续监测法(continuous monitoring assay)两大类。)两大类。第23页,此课件共72页哦1定时法定时法 这是这是早期早期测定酶活性浓度的测定酶活性浓度的方法方法。大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、强碱、蛋白沉
15、淀剂等终止酶促反应,测定强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应平均速度。计算酶促反应平均速度。第24页,此课件共72页哦这类方法有多种命名,如这类方法有多种命名,如“取样法取样法”、“终点法终点法”或或“两点法两点法”。用此类方法测定。用此类方法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确,否则会引起的温度下作用时间要很精确,否则会引起较大误差。较大误差。第25页,此课件共72页哦这种方法的优点是比较简单,因测定时酶这种方法的优点是比较简单,因测定时酶促
16、反应已被终止,故比色计或分光光度计促反应已被终止,故比色计或分光光度计无需保温设备,显色剂的选择也可不考虑无需保温设备,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。否都是零级反应。第26页,此课件共72页哦图图6-4显示定时法中酶促反应的三种可能过显示定时法中酶促反应的三种可能过程。虽然从程。虽然从t1到到t2三种反应所生成的产物量三种反应所生成的产物量相同,但实际反应过程有很大差别。相同,但实际反应过程有很大差别。曲线曲线1说明酶促反应速率接近终点时已经减慢,说明酶促反应速率接近终点时已经减慢,
17、曲线曲线2说明在反应早期存在延滞期。只有说明在反应早期存在延滞期。只有曲曲线线3时,用定时法可以准确测定代表酶活性时,用定时法可以准确测定代表酶活性浓度的反应速率。浓度的反应速率。第27页,此课件共72页哦第28页,此课件共72页哦因此,用定时法准确测定酶活性浓度,必因此,用定时法准确测定酶活性浓度,必须了解不同酶促反应速率和时间的关系,须了解不同酶促反应速率和时间的关系,应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期,确定线性时间,然后在这段时间进行期,确定线性时间,然后在这段时间进行测定,测定,避开避开延滞期和一级反应。延滞期和一级反应。第29页,此课件共72页
18、哦2连续监测法连续监测法 连续测定酶反应过程中某一连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是,这类方法勿需停止酶促反应,不同的是,这类方法勿需停止酶促反应,不需添加其他呈色试剂,就可测定反应物不需添加其他呈色试剂,就可测定反应物的变化,很容易观察到反应的整个过程。的变化,很容易观察到反应的整个过程。在以往的一段时期里,常把这类在以往的一段时期里,常把这类 方法称为方法称为“动力学法动力学法”
19、或或“速率法速率法”。第30页,此课件共72页哦这类测定方法简单,优点是可将多点的测这类测定方法简单,优点是可将多点的测定结果连接成线,很容易找到成直线的区定结果连接成线,很容易找到成直线的区段,以观察到是否偏离零级反应,因而可段,以观察到是否偏离零级反应,因而可选择线性反应期来计算酶活性,不需终止选择线性反应期来计算酶活性,不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间,反应。通常截取反应开始后较短的时间,就能近似地建立这种反应量与反应时间的就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系,不过这种时间范围因酶种类和线性关系,不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异,必须用实验方法反应条件而异,必须用
20、实验方法 进行确定。进行确定。第31页,此课件共72页哦连续监测法测定结果常较连续监测法测定结果常较定时法定时法高,且因高,且因在酶促反应初始阶段底物最充裕,而产物在酶促反应初始阶段底物最充裕,而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小,的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小,因而测定结果也较因而测定结果也较取样法取样法准确。准确。第32页,此课件共72页哦三、连续监测法测定酶活性浓度三、连续监测法测定酶活性浓度随着科学技术的不断进步与发展,各种自随着科学技术的不断进步与发展,各种自动生物化学分析仪的广泛使用,连续监测动生物化学分析仪的广泛使用,连续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测法已逐
21、步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。定酶活性浓度最常用的方法。第33页,此课件共72页哦(一)连续监测法的种类(一)连续监测法的种类1直接法直接法 这类方法是在不终止酶促反应条这类方法是在不终止酶促反应条件下,直接通过测定反应体系中底物或产件下,直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、性、pH、电导率、粘度等,从而计算出酶、电导率、粘度等,从而计算出酶活性浓度。活性浓度。第34页,此课件共72页哦其中以分光光度法应用最为广泛,也是方法学上最成熟其中以分光光度法应用最为广泛,也是方法学上最成熟的一种。利用的一种
22、。利用NAD(P)H在在340nm处的吸光度的变化测处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在在260nm波长和波长和340nm波长处有吸收峰,而氧波长处有吸收峰,而氧化型化型NADNADP只在只在260nm波长处有吸收峰,这波长处有吸收峰,这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。是因为分子中有腺嘌呤的缘故。340nm波长处吸光波长处吸光度的变化可以反映度的变化可以反映 反应体系中反应体系中NAD(P)H量的量的增减。增减。A+NAD(P)B+NAD(P)H脱氢酶第35页,此课件共72页哦还可利用一类人工合成的所谓还可利用一类人工合
23、成的所谓“色素原色素原”底物,其本身为无色或微黄色,酶作用后底物,其本身为无色或微黄色,酶作用后生成有色化合物,如目前应用硝基苯酚和生成有色化合物,如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。酶的测定。A B C酶促反应显色反应第36页,此课件共72页哦2间接法间接法 直接法虽然简单,但只有底物与直接法虽然简单,但只有底物与产物之间,在理化性质等方面有显著差异产物之间,在理化性质等方面有显著差异时,才能使用直接法。故至今也只有很少时,才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。目前可采一部分酶能用直接法进行测定。目前可采
24、用两类间接法进行酶学测定。用两类间接法进行酶学测定。第37页,此课件共72页哦一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂,这些试一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂,这些试剂只和酶反应物迅速作用,产生可被仪器检出的物质剂只和酶反应物迅速作用,产生可被仪器检出的物质变化,但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的变化,但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清例子是血清ChE(胆碱酯酶)的丁酰硫代胆碱测定法。(胆碱酯酶)的丁酰硫代胆碱测定法。另一类是目前应用最多,最为广泛的酶偶联法,即在原另一类是目前应用最多,最为广泛的酶偶联法,即在原反应体系中加入另一些酶试剂,所进行的酶促反应和被反应体系
25、中加入另一些酶试剂,所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。测酶反应偶联起来。第38页,此课件共72页哦(二)酶偶联反应(二)酶偶联反应最简单的酶偶联反应(单底物反应且只有一个最简单的酶偶联反应(单底物反应且只有一个工具酶工具酶)模式为:模式为:A B C被测定酶(被测定酶(Ex)催化的反应称为)催化的反应称为始发反应始发反应;产生被检;产生被检测物质产物测物质产物C(如(如NADH)的反应称为)的反应称为指示反应指示反应,相,相应的偶联酶(第二个酶)酶称应的偶联酶(第二个酶)酶称指示酶指示酶(Ei)。)。ExEi第39页,此课件共72页哦如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,如果一些
26、酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶,此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶,将二者连接起来,此反应称为将二者连接起来,此反应称为辅助反应辅助反应。模式为:。模式为:A B C D一般习惯将最后一个酶称指示酶(一般习惯将最后一个酶称指示酶(Ei),其他外加的酶),其他外加的酶称为称为辅助酶辅助酶(Ea)。个别情况还可能使用两种或以)。个别情况还可能使用两种或以上的辅助酶。将这一连串酶促上的辅助酶。将这一连串酶促 反应称为酶反应称为酶偶联体系。偶联体系。ExEiEa第40页,此课件共72页哦临床常规酶学分析所用的酶偶联法中,多临床常规
27、酶学分析所用的酶偶联法中,多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物NADH或或NADPH于于340nm处吸光度的变化处吸光度的变化速率,可以很容易地监测指示酶反应。速率,可以很容易地监测指示酶反应。第41页,此课件共72页哦用酶偶联法测定酶活性浓度时,并不是一开始反应就用酶偶联法测定酶活性浓度时,并不是一开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在几个时相:一是几个时相:一是预孵育期预孵育期,反应一开始只存在底物,反应一开始只存在底物A,不存在指示酶的反应,在此时相中使存在于样品中的干不存在指示酶的反应,在
28、此时相中使存在于样品中的干扰物质充分进行反应,将试剂中的扰物质充分进行反应,将试剂中的NADH变为变为NAD。二是二是延滞期延滞期,加入底物启动反应,在启动后的一段短时间,加入底物启动反应,在启动后的一段短时间内,产物内,产物B开始出现并逐渐增加,处于较低水平,指示开始出现并逐渐增加,处于较低水平,指示酶反应速度也较低,不能代表测定酶的酶反应速度也较低,不能代表测定酶的 反反应速率应速率Vx,这一时期称为延滞期。,这一时期称为延滞期。第42页,此课件共72页哦随着产物随着产物B增加到一定程度时,增加到一定程度时,Ex和和Ei反应速率相同,反应速率相同,达到了达到了稳态期稳态期。此阶段。此阶段3
29、40nm波长处吸光度才会有明波长处吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗,反应速度又复显的线性变化。最后由于底物消耗,反应速度又复减慢。减慢。图图6-5显示酶偶联法测定显示酶偶联法测定ALT时吸光度变化的扫描图时吸光度变化的扫描图谱。设计或选择酶测定方法时,如用酶偶联法,延谱。设计或选择酶测定方法时,如用酶偶联法,延滞期越短越好,测定时间一定要避开此期。滞期越短越好,测定时间一定要避开此期。第43页,此课件共72页哦第44页,此课件共72页哦当然也不是所有酶都适合用酶偶联法进行当然也不是所有酶都适合用酶偶联法进行测定。为了保证准确测定酶活性,酶偶联测定。为了保证准确测定酶活性,酶偶联反应
30、的反应速率应超过或等于测定酶的反反应的反应速率应超过或等于测定酶的反应速率,指示酶反应必须是应速率,指示酶反应必须是一级反应一级反应,即,即指示酶反应速率应和测定酶的产物指示酶反应速率应和测定酶的产物B浓度成浓度成正比。正比。第45页,此课件共72页哦只有当使用大量的指示酶,以及指示酶的只有当使用大量的指示酶,以及指示酶的Km很小时,才能做到这一点。一般说来酶很小时,才能做到这一点。一般说来酶偶联法中所用的指示酶偶联法中所用的指示酶Km值都很小,酶促值都很小,酶促反应最适反应最适pH应与工具酶的反应最适应与工具酶的反应最适pH相接相接近。当然在选用指示酶时还应从经济方面近。当然在选用指示酶时还
31、应从经济方面考虑选用一些来源容易且价格便宜的酶制考虑选用一些来源容易且价格便宜的酶制剂。剂。第46页,此课件共72页哦(三)干扰因素(三)干扰因素临床测定酶活性浓度标本都是体液,其中临床测定酶活性浓度标本都是体液,其中除测定酶外,还存在着其他各种酶和其他除测定酶外,还存在着其他各种酶和其他物质,因此在实测反应中可能出现一些副物质,因此在实测反应中可能出现一些副反应或旁路反应,这些都会对测定反应产反应或旁路反应,这些都会对测定反应产生干扰。生干扰。第47页,此课件共72页哦1其他酶和物质的干扰其他酶和物质的干扰反应体系各成分除可能引起测定酶反应外,还有可反应体系各成分除可能引起测定酶反应外,还有
32、可能引起其他酶的反应而干扰测定。例如酶偶联法测能引起其他酶的反应而干扰测定。例如酶偶联法测ALT时,由于反应体系中含有大量时,由于反应体系中含有大量NADH和和LD(H),可与血液标本中所含丙酮酸反应,引起可与血液标本中所含丙酮酸反应,引起340nm波长处吸波长处吸光度下降,从而引起光度下降,从而引起ALT活性测定误差。活性测定误差。第48页,此课件共72页哦又如红细胞中腺苷酸激酶(又如红细胞中腺苷酸激酶(AK)对)对CK测定的干扰,测定的干扰,在在CK测定的酶偶联体系中测定的酶偶联体系中ADP是是CK的底物,但它又的底物,但它又同时是同时是AK的底物,二个酶反应都产生的底物,二个酶反应都产生
33、ATP。ATP在试在试剂中与己糖激酶(剂中与己糖激酶(HK)和)和G6PD作用会形成作用会形成NADH引引起起340nm波长处吸光度的上升,出现波长处吸光度的上升,出现CK酶活性结果酶活性结果偏高。为避免此干扰,一般在反应体系中加入偏高。为避免此干扰,一般在反应体系中加入AK的的抑制剂抑制剂腺苷酸腺苷酸(AMP)和二腺苷五磷酸()和二腺苷五磷酸(AP5A)。)。第49页,此课件共72页哦2酶的污染酶的污染 因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取,易污染因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取,易污染其他酶,如不设法除去将引起测定误差。如组织匀浆其他酶,如不设法除去将引起测定误差。如组织匀浆中往往含有中往
34、往含有NADH-细胞色素细胞色素C还原酶,它将干扰各种还还原酶,它将干扰各种还原酶的测定。使用的酶制剂(如工具酶)必须提纯。例如原酶的测定。使用的酶制剂(如工具酶)必须提纯。例如测测AST时,被苹果酸脱氢酶所污染的时,被苹果酸脱氢酶所污染的AST不应超过相对不应超过相对量的量的 510-5(0005)。)。第50页,此课件共72页哦3非酶反应非酶反应 有些底物不稳定,没有酶的作用就会自行反应。例有些底物不稳定,没有酶的作用就会自行反应。例如很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定,放置一如很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定,放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。类似情况还可见于一段时间可自行水
35、解释放出硝基酚。类似情况还可见于一些内部因素如些内部因素如pH变化而引起的空白对照的变化。又如测变化而引起的空白对照的变化。又如测定定ALD(醛缩酶)时,其底物醛类化合物可以和(醛缩酶)时,其底物醛类化合物可以和NAD 起非酶反应产生一种具有类似起非酶反应产生一种具有类似NADH的吸收光谱的吸收光谱 的衍生物,给测定带来困难。的衍生物,给测定带来困难。第51页,此课件共72页哦4分析容器的污染分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混杂有其他一如分析容器或管道污染而混杂有其他一些物质,可能影响酶的活性。如微量重金些物质,可能影响酶的活性。如微量重金属可使酶失活,残留的表面活性剂可能抑属可使酶失活
36、,残留的表面活性剂可能抑制酶活性。制酶活性。第52页,此课件共72页哦5沉淀形成沉淀形成 使用分光光度法测定酶活性时,如有沉使用分光光度法测定酶活性时,如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化。常加入吸光度变化。常加入表面活性剂表面活性剂以防止颗以防止颗粒从匀浆中析出。有些酶反应需镁离子作粒从匀浆中析出。有些酶反应需镁离子作为辅因子,如反应液中含有多余磷酸根时为辅因子,如反应液中含有多余磷酸根时将有沉淀出现。将有沉淀出现。第53页,此课件共72页哦解决上述干扰问题的方法之一可通过解决上述干扰问题的方法之一可通过试剂试剂空白管空白管检出并加以校正。
37、即有时不仅要作检出并加以校正。即有时不仅要作标本对照管,还要作试剂空白管。另一个标本对照管,还要作试剂空白管。另一个有效途径就是不用单一试剂而改用有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂双试剂测定酶活性。测定酶活性。第54页,此课件共72页哦四、工四、工 具具 酶酶通常把酶学分析中作为试剂用于测定通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合化合物浓度物浓度或或酶活性浓度酶活性浓度的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。常使用酶偶联体系进行测定,指示酶和辅常使用酶偶联体系进行测定,指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。助酶作为反应系统中的试剂。第55页,此课件共72页哦(一)常用工具酶及其质量要求(一)常用工具酶及其
38、质量要求常用工具酶多为氧化还原酶类,这是因为常用工具酶多为氧化还原酶类,这是因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。其产物最易被直接监测而成为指示酶。在一系列利用工具酶的反应中,主要限速在一系列利用工具酶的反应中,主要限速因子应该是待测化合物和待测酶,工具酶因子应该是待测化合物和待测酶,工具酶和其辅助底物应过量。和其辅助底物应过量。第56页,此课件共72页哦工具酶纯度不必要求过高,这样才能降低工具酶纯度不必要求过高,这样才能降低其作为试剂的成本。但对工具酶试剂中的其作为试剂的成本。但对工具酶试剂中的杂质(杂酶、抑制剂等)的含量要有一定杂质(杂酶、抑制剂等)的含量要有一定的限制,以保证工具酶一定的
39、的限制,以保证工具酶一定的比活性比活性和纯和纯度,减少或避免一些干扰测定的不必要的度,减少或避免一些干扰测定的不必要的副反应。副反应。第57页,此课件共72页哦(二)工具酶参与的指示反应(二)工具酶参与的指示反应近年来,在临床生物化学检验中,许多项近年来,在临床生物化学检验中,许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理,即所谓共通(或通用)反应的反应原理,即所谓共通(或通用)反应途径。途径。第58页,此课件共72页哦最常用的有两类分光光度法,一类是利用较高特异性最常用的有两类分光光度法,一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢(的氧化酶产生过氧化氢
40、(H2O2),再加氧化发色剂),再加氧化发色剂比比色色;另一类是利用氧化;另一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正逆反应后,直接通过分光的正逆反应后,直接通过分光光度法或其他方法测定光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。的变化量。表表6-4显示临床常用的共通性呈色反应。显示临床常用的共通性呈色反应。第59页,此课件共72页哦第60页,此课件共72页哦1偶联偶联H2O2的工具酶及其指示反应的工具酶及其指示反应临床化学测定中,可利用葡萄糖氧化酶、临床化学测定中,可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、甘油氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶
41、、甘油氧化酶、丙酮酸氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、丙酮酸氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、胆固醇、甘油、丙酮酸的测定,可尿酸、胆固醇、甘油、丙酮酸的测定,可使相应底物被氧化生成使相应底物被氧化生成H2O2。第61页,此课件共72页哦H2O2主要通过以氢(或电子)为受体的指主要通过以氢(或电子)为受体的指示酶反应进行检测。示酶反应进行检测。有两类工具酶参与反应:有两类工具酶参与反应:过氧化氢酶过氧化氢酶或称或称触酶(触酶(catalase)及)及过氧化物酶过氧化物酶(peroxidase,POD),两者均为含三价铁),两者均为含三价铁的指示酶,以指示酶的指示酶,以指示酶POD最为常用。最为常用
42、。第62页,此课件共72页哦血糖测定(葡萄糖氧化酶法)血糖测定(葡萄糖氧化酶法)葡萄糖葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉+苯酚苯酚 醌亚胺醌亚胺+4 H2O过氧化物酶(红色)葡萄糖氧化酶第63页,此课件共72页哦血清总胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)血清总胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)胆固醇酯胆固醇酯+H2O 胆固醇胆固醇+脂肪酸脂肪酸胆固醇胆固醇+O2 4-胆甾氧化烯酮胆甾氧化烯酮+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉+苯酚苯酚 醌亚胺醌亚胺+4 H2O胆固醇酯酶胆固醇氧化酶过氧化物酶(红色)第64页,此课件共72页哦2NAD(P)
43、或或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其偶联的脱氢酶及其指示反应指示反应许多氧化还原反应,尤其是作为工具酶的许多氧化还原反应,尤其是作为工具酶的脱氢酶如脱氢酶如 LD(H)、GLD(谷氨酸脱氢酶)(谷氨酸脱氢酶)、G6PD等参与时,常将底物的氢原子去除等参与时,常将底物的氢原子去除后传递给后传递给NAD(P)而形成而形成NAD(P)H。第65页,此课件共72页哦LD主要以主要以NADNADH为辅酶,而为辅酶,而GLD则不论来自则不论来自肝或细菌,均可以肝或细菌,均可以NADNADP 或其还原型为辅酶。或其还原型为辅酶。因因NAD(P)H在在340nm有特征性光吸收,可借此用分有特征性光吸收,可借此用
44、分光光度法进行检测。光光度法进行检测。目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、-羟羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD(H)、GLD(谷氨酸脱氢酶)、(谷氨酸脱氢酶)、CK、ALD(醛缩酶)、(醛缩酶)、G6PD和和ICD(异柠(异柠 檬酸脱氢酶)檬酸脱氢酶)第66页,此课件共72页哦此外,此外,酶循环法酶循环法(enzymatic cycling methods)采用两类工具酶进行循环催化反)采用两类工具酶进行循环催化反应,使被测物放大扩增,从而使检测灵敏应,使被测物放大扩增,从而使检测灵敏度提高。
45、目前已应用于临床常规总胆汁酸度提高。目前已应用于临床常规总胆汁酸的测定。的测定。第67页,此课件共72页哦为了简化操作过程,并使酶试剂得以方便为了简化操作过程,并使酶试剂得以方便或反复使用,已有许多研究将水溶性的酶或反复使用,已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上,分子间共价交联等方法固定在支持物上,并保持其原有的活性,这样制备的酶称为并保持其原有的活性,这样制备的酶称为固相酶固相酶(或固定酶)(或固定酶)(immobilized enzyme)。)。第68页,此课件共72页哦近些年来,固相酶技术发展迅
46、速,特别是近些年来,固相酶技术发展迅速,特别是固相酶膜固相酶膜的应用使临床生物化学检验进入的应用使临床生物化学检验进入了干化学的时代,一些测定变得更加方便、了干化学的时代,一些测定变得更加方便、快速。快速。酶电极酶电极、酶探针酶探针等也在不断研制开发中,等也在不断研制开发中,相信此类技术将成为临床生物化学发展的相信此类技术将成为临床生物化学发展的一个新方向。一个新方向。第69页,此课件共72页哦定量分析的单位定量分析的单位进行微量分析及超微量分析时,多需采用仪器分析方进行微量分析及超微量分析时,多需采用仪器分析方法。法。根据试样被测组分的百分含量,可粗略地分为常量组根据试样被测组分的百分含量,
47、可粗略地分为常量组分分(1)、微量组分、微量组分(0.011)及痕量组分及痕量组分(0.01)。这些组分的分析又分别称为常量组分分析、微量组分分析这些组分的分析又分别称为常量组分分析、微量组分分析及痕量组分分析。及痕量组分分析。第70页,此课件共72页哦痕量组分的含量还常用痕量组分的含量还常用ppm(parts permillion;10-6 WW或或vv百万分率百万分率)、ppb(parts perbillion;10-9 WW 或或VV;十亿分率;十亿分率)及及 ppt(parts pertrillion;10-12 WW或或VV;万亿分率;万亿分率)表示。它们是表示。它们是百分含百分含量量的一种表示方法,与的一种表示方法,与重量单位重量单位ug(10-6g)、ng(10-9g)及及pg(10-12g)不同。不同。第71页,此课件共72页哦英文缩写英文缩写乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶(LD/LDH)异柠檬酸脱氢酶(异柠檬酸脱氢酶(ICD)6-磷酸葡萄糖脱氢酶(磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)谷氨酸脱氢酶(谷氨酸脱氢酶(GLD)单胺氧化酶(单胺氧化酶(MAO)-谷氨酰转移酶(谷氨酰转移酶(-GT/GGT)糖原磷酸化酶(糖原磷酸化酶(GP)-羟丁酸脱氢酶(羟丁酸脱氢酶(-HBD)第72页,此课件共72页哦
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