牡蛎疱疹病毒1型检测技术规范 巢式PCR法(定稿).doc
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1、ICS 11.220B 41DB37山东省 地方标准DB 37/T XXXXXXXXX牡蛎疱疹病毒 型检测技术规范 巢式 PCR 法Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCRXXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施山东省市场监督管理局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI目 次前 言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和缩略语.13.1 术语和定义.1 3.2 缩略语.14 试剂及仪器.14.1 试剂.2 4.2 仪器.25 采样.35.1 采样对象.3 5.2 采样数量、方法和保
2、存运输.3 5.3 样品的采集.36 检测.36.1 DNA 的提取 .3 6.2 巢式 PCR 操作步骤.3 6.3 电泳及测序.47 结果.47.1 结果判定.4 7.2 结果表述.4附 录 A (规范性附录) 试剂及配制方法.5附 录 B (资料性附录) 检测目的片段的 DNA 序列及电泳图.7DB37/ XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC 03)归口。 本标准起草单位:山东农业大
3、学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、 泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生 物科技有限公司。 本标准起草人:王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。DB37/ XXXXXXXXX1牡蛎疱疹病毒型检测技术规范 巢式 PCR 法1 范围本标准规定了牡蛎疱疹病毒型(Ostreid herpesvirus-1,OsHV-1)的巢式PCR检测方法,适用于 对贝类样品进行疱疹病毒型带毒情况的定性检测,以进行牡蛎疱疹病毒型的流行病学调查、诊断、 检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不
4、可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7205.1 牡蛎包纳米虫病诊断规程3 术语和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 牡蛎疱疹病毒型 牡蛎疱疹病毒型属于软体动物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、牡蛎疱疹病毒属 (Ostreavirus),是一种双链DNA病毒,在世界范围内广泛流行,主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种 双壳贝类,对贝类养殖业造成重大的损害。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。 bp
5、:碱基对(base pair) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) EB:溴化乙啶(ethidium bromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) Taq:水生栖热菌(thermus aquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTA TrisHCl) Tris:三羟甲基氨基甲烷(tris hydroxyme
6、thyl aminomethane)4 试剂及仪器DB37/ XXXXXXXXX24.1 试剂4.1.1 除非另有说明,实验用水均为 GB/T 6682 规定的三级水或相当纯度的水。 4.1.2 无水乙醇:分析纯。 4.1.3 TE 缓冲液按附录 A.1 的规定。 4.1.4 抽提缓冲液按附录 A.2 的规定。 4.1.5 蛋白酶 K 按附录 A.3 的规定。 4.1.6 10 mol/L 乙酸铵按附录 A.4 的规定。 4.1.7 Tirs 饱和酚(pH7.8):分析纯。 4.1.8 4.1.8 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):分析纯。 4.1.9 4.1.9 氯仿/异戊醇(24:1):
7、分析纯。 4.1.10 50TAE:见附录 A.5,也可以直接购买市售产品。 4.1.11 1TAE:见附录 A.5。 4.1.12 70 %乙醇按附录 A.6 的规定。 4.1.13 dNTP(各 2.5 mmol/L):生化试剂,含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 2.5 mmol/L 的混合物, -20 保存,用于 PCR。 4.1.14 10PCR 反应缓冲液:见附录 A.7,也可以直接购买市售产品。 4.1.15 MgCl2 (25 mmol/L):生化试剂,-20 保存。 4.1.16 Taq DNA 聚合酶(5 U/L):生化试剂,-20 保存。 4.1.17 外引物
8、 CF:5-ATTACCCAGATTCCCCTC-3,-20 保存。 4.1.18 外引物 CR:5-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3,-20 保存。 4.1.19 内引物 C3:5-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3,-20 保存。 4.1.20 内引物 C2:5-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3-20 保存。 4.1.21 PCR 检测阳性对照:已知受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品,-80 保存。 4.1.22 PCR 检测阴性对照:已知未受牡蛎疱疹病毒 型感染的贝类组织样品,-80 保存。 4.1.23 PCR 检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。
9、4.1.24 琼脂糖:分析纯。见附录 A.8。 4.1.25 6Loading Buffer:附录 A.9,也可以直接购买市售产品。 4.1.26 DNA 分子量标准。 4.1.27 溴化乙锭(EB):分析纯,10 mg/mL,见 A.10,或其他等效产品。4.2 仪器4.2.1 离心机。 4.2.2 PCR 仪。 4.2.3 电泳仪。 4.2.4 水平电泳槽。 4.2.5 凝胶成像系统或紫外仪。 4.2.6 多功能振荡器。 4.2.7 水浴锅或金属浴。 4.2.8 -20 普通冰箱。 4.2.9 80 超低温冰箱。 4.2.10 微波炉电炉或其他加热设备。 4.2.11 微量移液器:量程 0
10、.5 L1 000 L。DB37/ XXXXXXXXX35 采样5.1 采样对象牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。5.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合SC/T 7205.1的要求。5.3 样品的采集稚贝(附着后2 mm)和幼贝(2 mm3 cm)取内脏团;成贝(3 cm)取外套膜和斧足。 样品采集后分别置于1.5 mL离心管中,立即进行DNA提取操作或暂时保存于-20 。6 检测6.1 DNA 的提取6.1.1 取 30 mg50 mg 组织样品,加入抽提缓冲液 500 L,充分研磨,37 温浴 1 h。提取过程 同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。 6.1.2 加入
11、 2.5 L 20 mg/mL 蛋白酶 K,至终浓度 100 g/mL,混匀后置于 50 水浴 3 h,不时旋 动。 6.1.3 将溶液冷却至室温,加入等体积平衡酚,颠倒混合 10 min,于 10 000 r/min 离心 3 min 分离 两相。 6.1.4 水相移至新 1.5 mL 离心管中,加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混合 10 min,于 10 000 r/min 离心 1 min 分离两相。 6.1.5 水相移至一新 1.5 mL 离心管中,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混合 10 min,于 10 000 r/min 离心 1 min 分离两相。
12、6.1.6 水相移至一新 1.5 mL 离心管中,加入 100 L 10 mol/L 乙酸铵,混匀后,再加入两倍体积预 冷无水乙醇(-20 )混匀,-20 放置 2 h。10 000 r/min 离心 10 min,弃上清。 6.1.7 用 70 %乙醇洗涤沉淀 2 次,每次 10 000 r/min 离心 5 min,倾去上清,沉淀于室温晾干。 6.1.8 加入 100 L 灭菌双蒸水溶解 DNA。 6.1.9 若 DNA 样品需要保存,可溶解于 100 L TE 缓冲液中并保存于-20 。 6.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化 DNA 抽提试剂盒。6.2 巢式 PCR
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- 牡蛎 疱疹病毒 检测 技术规范 PCR 法定
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