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1、动物病毒学Koch柯赫法则(研究微生物的准则)特殊的病原菌应在同一疾病中可查见,在健康者不存在此病原菌能被分离培养而得到纯培养物此纯培养物接种易感动物,能导致同样病症自感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养病毒的基本特征(病毒与其它微生物的区别)(Lwoff-Tournier, 1966)不具有细胞结构,也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动病毒体只含有一种类型的核酸:或DNA或RNA特殊的繁殖方式:复制缺乏完整的酶系统,不具备能量合成系统,也不具有核糖体绝对的细胞内寄生对抗生素不敏感某些RNA病毒(反转录病毒)的RNA经反转录合成cDNA,与细胞基因组整合,并随细胞DNA 的复制而增殖,即DN
2、A前病毒疝,目其他微生物的区列奥就微生物 类型在无生 命的培 养基中 生长二等分 裂繁殖核酸类 型有无自 己的核 糖体是否含 有胞壁 酸敏感性制霉菌 素抗生素干扰素真菌+D+R+-细菌4-+D+R+-+-螺旋体一或+D+R+-+-支原体+D+R+-十立克次 体一+D+R+衣原体+D+R+-+病毒复制D或R-+病毒的起源病毒是原始生物物种的后裔,是一种细胞前的原始生命形式病毒是细胞内寄生性微生物退行进化的产物病毒来源于细胞的遗传物质病毒学的研究内容与目的意义研究内容病毒的形态结构、理化性质、起源进化、分类命名、遗传变异病毒与病毒之间的相互作用关系病毒与宿主之间的相互作用关系病毒在生物学、医学、农
3、林牧业、环保和工业等领域的应用目的意义控制各种病毒性疾病的发生与流行:病毒能引起人类、家畜和作物很多危害性疾病利用病毒为人类造福:利用病毒防治有害生物、利用病毒作为外源基因的表达载体构建活载 体疫苗或制备亚单位疫苗等。推动了现代生物学及分子生物学的研究思考题1、病毒的基本特征(病毒与其它微生物的本质区别)?2、病毒的定义?3,有关病毒起源的假说?4、了解病毒学发展过程中发生的重大事件和关键人物及其贡献?5、病毒学研究的内容与目的意义是什么?第二章病毒体的性质病毒蛋白质的功能构成病毒衣壳和囊膜的重要成分保护病毒核酸参与病毒的吸附与侵入过程,决定病毒对宿主和组织的嗜性构成病毒的表面抗原,能刺激机体
4、对相应病毒产生免疫应答反应构成病毒的血凝素,使病毒具备血凝特性构成病毒的酶类,如逆转录病毒的逆转录酶,-RNA病毒和呼肠孤病毒的RNA聚合酶,正粘 病毒和副粘病毒的神经氨酸酶等。参与病毒复制过程的酶的来源1、宿主细胞的酶或经病毒诱导修饰了的宿主细胞酶2、病毒的一些非结构蛋白(如脊髓灰质炎病毒的依赖于RNA的RNA多聚酶)3、存在于病毒体中的前: 参与病毒的侵入、释放过程:溶菌酶、神经氨酸酶 参与病毒的大分子合成的酶:逆转录酶、依赖DNA的RNA多聚酶、修饰酶病毒的脂类的特性来自于宿主细胞,具有宿主细胞的特性主要存在于包膜中,是构成病毒包膜脂质双层不可缺少的部分与病毒的吸附、侵入和释放过程有关病
5、毒的碳水化合物的特性(戊糖以外的糖类)来自宿主细胞主要存在于包膜中:糖蛋白、糖脂噬菌体DNA的喀嚏上附着有葡萄糖残基正粘病毒和副粘病毒的刺突也是由糖蛋白所构成糖蛋白能刺激机体产生Ab理化因子对病毒的作用保护作用:有益于病毒的生存诱变作用:造成病毒某些生物学特性的改变灭活作用:使病毒活性丧失物理因子作用机制:使病毒蛋白质,特别是病毒的表面蛋白质变性。核酸对热的抵抗力较强。影响因素:蛋白质、钙、镁一一降低病毒对热的敏感性蛋白酶、核酸酶一一增强病毒对热的敏感性电离辐射电离辐射中的X射线和丫射线作用于其它物质后产生次级电子,次级电子再通过直接和间接 作用,作用于病毒核酸(DNA或RNA)而使病毒失活。
6、紫外线机制:使嗜咤碱基之间形成二聚体DNA: TT、 CT, CC RNA: UU核酸链断裂分子内或分子间交联核酸和蛋白质之间的交联核酸不能复制和转录,从而导致病毒的灭活,但病毒蛋白质的免疫原性仍保持。反转录病毒和埃博拉病毒很难被紫外线杀灭超声波(20kHz的声波) 主要以强烈振荡作用对病毒、其它微生物以及细胞呈现杀灭或破坏作用。 病毒学中的应用:破碎细胞,释放病毒粒子pHFMDV:在 pH6. 0-6. 5 和 pH8. 0-9. 0 均迅速灭活鼻病毒:pH5.3迅速灭活呼肠孤病毒:pH5.3稳定肠道病毒:PH2.2在24h内保持感染性披膜病毒:PH8.0以上稳定甲醛和成二醛机制:1、与腺口
7、票吟、鸟噤吟、胞喀咤的胺基结合2、与蛋白质的胺基结合3、对病毒的核酸和蛋白质都有破坏作用,但首先是作用于病毒的核酸应用:用于灭活病毒生产疫苗浓度:0. 05-0. 2% (福尔马林)戊二醛对病毒的作用与甲醛相似,但灭活作用更强,常用于实验室污染器材消毒。烷化剂机制:烷化剂上的活性烷基使蛋白质分子上游离的-C00H、-NH2、-SH、-0H和核酸分子中的N发生烷基化作用,使病毒的蛋白质和核酸结构改变,功能丧失,从而被灭活。种类:环氧乙烷、环氧丙烷、澳化甲烷、B一丙内酯、乙酰乙烯亚胺等病毒学中的应用:气体消毒剂、灭活病毒、制备疫苗蛋白质变性剂石炭酸阴离子去污剂:SDS、去氧胆酸钠 非离子去污剂:吐
8、温-20、吐温-80、NP-40 尿素、M石炭酸:剥离病毒粒子的蛋白质衣壳SDS:剥离病毒粒子的蛋白质衣壳;使蛋白质降解为多肽;溶解病毒囊膜吐温和去氧胆酸钠:破坏病毒的囊膜,但可保存病毒粒子原来的蛋白结构和抗原性。NP-40:裂解病毒蛋白质服素、m:破坏氢键和氨基酸残基的非极性侧链之间的疏水键,使蛋白质变性保护剂能够减轻病毒保存过程中其他理化学因子对病毒的损伤,从而保持病毒的感染性、抗原性等 生物活性的物质。甘油:在50%的甘油盐水,病毒可存活达几十天、几个月至几年(牛瘟病毒例外)。二甲基亚硼(DMS0):减少冷冻过程中微小冰晶的形成病毒冻干用保护剂明胶、血清、陈、白蛋白、谷氨酸、脱脂奶、乳糖
9、、葡萄糖、蔗糖、山梨醇等不同保护剂的作用机制不同:低分子物质(5%-10%的糖类、5%谷氨酸钠):使干燥样品中的最终水分含量不致过低,可 防止蛋白质的变性。高分子物质(血清、明胶、白蛋白):促进病毒制品在冻干过程中的升华干燥,当冻干的病 毒加水复原时,可提高溶解性。病毒的短期保存直接置-30C冰箱中保存悬浮于50%甘油盐水中,再置-30C冰箱中保存思考题1、根据宿主范围的不同,将病毒分为哪几类?2、病毒的壳体结构有哪几种类型?3、病毒囊膜的特点。4、长期保存病毒主要采用哪几种方法?5、结构蛋白和非结构蛋白的划分依据是什么?其功能如何?6、病毒核酸的一些基本特征?7、各种理化因子对病毒的作用。8
10、、根据你的理解谈一谈在病毒学研究中该如何利用理化因子对病毒的作用?第三章病毒的分类与命名1.病毒分类系统:采用目、科、亚科、属和种的等级制度,在种的命名尚不完善的情况下, 许多病毒可用国际通用的俗名。一些属性不很明确的属或暂定属,用引号或后缀“Tike viruses”表示,如Norwalk-like viruseso动物病毒的命名现状种的命名病名加“病毒”:CSFV、AIV、FMDV、HBV、PRRSV地名加病名加“病毒” :JEV、EEEV, WEEV地名加“病毒” :NDV、MBV、EBV人名加病毒:Marek s disease virus科、属的命名病毒粒子的形态/理化学特性:小RN
11、A病毒科、反转录病毒科、弹状病毒科、轮状病毒属 病变性质:疱疹病毒科、痘病毒科病毒酶作用的基质:正粘病毒科、副粘病毒科最初分离部位:腺病毒科感染宿主的部位:鼻病毒属、肠道病毒属缩拼词:呼肠孤病毒科3.3动物病毒的分类依据1 .病毒的形态学特征病毒粒子的大小和形状;有无表面纤突和纤突的特征;有无囊膜;衣壳对称型和结构2 .理化学特性病毒粒子的分子量、浮密度、沉降系数;对酸碱的稳定性;对热的稳定性;对两价阳离子的 稳定性;对去污剂的稳定性;对脂溶剂的稳定性;对辐射的稳定性3 .核酸的类型、结构及相对分子量核酸类型:DNA或RNA;单股还是双股;线状还是环状;是单一的还是分节段的,节段的大 小和数目
12、;基因组大小4 .量白质结构蛋白的数目、大小和功能活性;非结构蛋白的数目、大小和功能活性;蛋白质的特殊功 能活性(转录酶、反转录酶、血凝素、神经氨酸醐等)5 .脂质、糖类含量和特性6 .在细胞培养中的生长特性对细胞种类的特异性;病毒蛋白的聚集场所;病毒粒子的装配场所;病毒粒子成熟和释放的 部位和性质7 .抗原性与其他相关病毒的血清学关系8 .生物学特性自然宿主范围、传播方式、传播介体,地理分布、致病性及与疾病的关系;组织嗜性和组织 病理学9 .4动物病毒的分类现状国际病毒分类委员会第九次报告(2012年)将已有的病毒根据核酸类型分为3大类群:1. DNA病毒类 2. RNA病毒类 3. DNA
13、与RNA的反转录病毒类ICTV的第九次分类报告将ICTV所承认的2284种病毒和类病毒归入349个属,19个亚科,87个科,6个目,脊椎动物病毒有31个科,无脊椎动物病毒有7个科。6个目:尾病毒目(Caudovirales):噬菌体芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales):甲型线形病毒科小RNA病毒目(Picornavirales):小RNA病毒科疱疹病毒目(Picornavirales):疱疹病毒科尼多病毒目(套式病毒目)(Nidovirales):冠状病毒科、动脉炎病毒科、杆套病毒科 单负股病毒目(Mononegavirales):副粘病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、波纳病毒科 思考题动
14、物病毒的分类原则是什么?目、科、亚科、属的词尾分别是什么?请举例说明国际流感病毒的命名方法?动物病毒的分类现状是怎样的?第四章病毒的复制病毒的生命存在形式: 细胞外的具有感染性的颗粒形式一病毒体细胞内的具有繁殖性的基因形式一病毒基因组 用于病毒复制研究的实验系统噬菌体细菌培养系统;动物病毒一一动物细胞培养系统植物病毒一一植物原生质体培养系统 胞膜:吸附、侵入、囊膜的获得、释放 胞浆:生物合成、装配、包涵体形成 胞核:生物合成、装配、囊膜的获得、包涵体形成 传代细胞系的优缺点: 优点:1)可以无限地传代。2)不少细胞系对病毒很敏感。3)可在悬浮培养条件下培养,适合病毒抗原的大量生产。4)生长旺盛
15、,繁殖快速,对营养条件不苛刻。缺点:1)对分离野毒不敏感2)在传代过程中遭到支原体和病毒的污染常用传代细胞系的种类BHK-21:仓鼠肾传代细胞系;PK-15:猪肾传代细胞系:IBRS-2:猪肾传代细胞系;Hela: 人的子宫瘤细胞系:Vero:非洲绿猴肾细胞系;Marc-145:来源于Vero细胞系;TKT43: 人的胸昔激酶阴性细胞系:CHO:中国仓鼠卵巢细胞;Sf9、Hif5:昆虫细胞系 三、细胞的保存与复苏 细胞的保存细胞培养物的常温短期保存1 .实验室中细胞的短期保存将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22C下避光保存,可达15天以上。 将细胞培养温度由37c降至32c甚至30,可隔
16、15-30天传代一次。2 .长途运送细胞培养物的保存取刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶(勿使培养瓶内存留空气), 随后用橡皮塞紧塞瓶口,并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25C左右。到达目的地后,置37培养1天,再行传代。细胞培养物的长期保存1 .将刚长满单层的细胞,按细胞传代方法消化吹散后,装入离心管中。2 . 2000-3000r/min 离心 5Tomin。3 .用适量的含有20%犊牛血清、10%二甲亚碉(DMSO)的DMEM悬浮,分装于细胞冻存管中。 4.置4 2h, -20 2h, -70过夜,然后置于液氮中长期保存。一或在液氮气相中过夜,然后置于液氮
17、中长期保存。一或置于液氮气相中,按5min Icni的速度逐渐往下降,直至液氮中长期保存。将冻存管放入装有异丙醇的程序降温盒中,再置-80C过夜晚,后放入液氮 细胞的复苏1、将冻存于液氮中的细胞取出。2、迅速置于42-50水浴中,并不停地摇动,使其快速解冻。3、2000-3000r/min 2-5min离心去掉冻存液,用生长液悬浮,再置于细胞培养瓶中进行培 养。或者不离心直接转移到细胞培养瓶中,等其贴壁几小时后,再换入新的生长液继续培养。动物病毒由于不同的结构类型和不同的侵入方式,脱壳过程较为复杂:呼肠孤病毒,不发生完全的脱壳,以内吞方式进入细胞后,吞噬泡与溶能体结合形成次级溶 酶体,病毒外壳
18、中近50%的壳体被溶酶体中的蛋白酶水解,余下的壳体与病毒核心形成亚病 毒颗粒,病毒基因组的转录均在亚病毒颗粒内进行。动物病毒由于不同的结构类型和不同的侵入方式,脱壳过程较为复杂:无论哪种动物病毒,为了病毒基因组的有效表达,病毒体至少需要部分脱壳。有囊膜的病毒首先得除去囊膜,再脱去壳体通过膜融合或内吞方式进入细胞的病毒,囊膜已经在与细胞质膜、溶醐体膜、或核内体膜融 合时除去,核壳直接进入胞质,并进一步脱去壳体。1 .呼肠孤病毒,无囊膜病毒,但有两层二十面体对称壳体,并不发生完全的脱壳以内吞方式进入细胞后,吞噬泡与溶酶体结合形成次级溶酶体,病毒外壳中近50%的壳体被 溶酶体中的蛋白酶水解,余下的壳
19、体与病毒核心形成亚病毒颗粒,病毒基因组的转录均在亚 病毒颗粒内进行。2 .有些在细胞核内增殖的DNA病毒,如乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒,其核衣壳在未被 完全脱壳的情况下就进入细胞核,在核内完成脱壳。3 . 口蹄疫病毒可能就在细胞膜上脱掉衣壳,病毒核酸直接进入细胞内。4 .痘病毒双链DNA病毒,但病毒大分子的合成和装配都发生在细胞质内。痘病毒可以经膜融合或内吞方式进入细胞质内,其脱壳分两步进行:第一步:外层囊膜在胞膜或吞饮泡膜上被融合,病毒核心释放入细胞质内。第二步:进入胞质内的核心借助自身衣壳上的依赖DNA的RNA聚合酶合成mRNA,进一步译 制出一些早期蛋白质,这些蛋白质中有脱壳醐,该醐对
20、病毒核心进一步脱壳,最终将病毒 DNA释放入细胞质内。1.病毒核酸的复制和蛋白质的合成分成5个连续的阶段:mRNA的早期转录:病毒核酸复制以前的转录mRNA的早期翻译:合成早期蛋白质包括:酶:在病毒的核酸复制、晚期转录和晚期翻译中发挥作用其它蛋白质(功能蛋白质):参与改变或抑制宿主细胞大分子合成(影响细胞正常生物合成)。 病毒核酸的复制:病毒的核酸携带病毒的全部遗传信息,通过自我复制产生许多完全相同的 子代病毒基因组。不同科的病毒所含的核酸类型、基因组结构和所利用的复制酶不同,因此,它们具有不同的 复制方式和特点,但病毒基因组的复制都遵循原核和真核生物DNA复制的碱基互补配对原 则。mRNA的
21、再度转录(晚期转录):发生在病毒基因组复制之后的转录。在新合成的RNA聚合前 的作用下,由母代病毒和子代病毒的DNA进一步转录出第二批mRNA。某些RNA病毒则仍由 RNA直接转录。mRNA的再度译制(晚期翻译):合成晚期蛋白质,包括病毒衣壳蛋白、囊膜蛋白以及病毒编 码的其它蛋白。装配和释放(assembly and release)I、装配(成熟):新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程。 无囊膜病毒壳体与核酸结合形成的核衣壳即为成熟的病毒;有囊膜病毒需要在核衣壳外加上 囊膜。无囊膜的病毒:壳体的装配壳体与病毒核酸的结合有囊膜的病毒:壳体的装配壳体与病毒核酸的结合出
22、芽获得囊膜装配效率不高。只有约50%的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子。释放:新形成的子代病毒粒子由细胞内到细胞外的过程。释放方式:裂解释放(lysis):杀细胞病毒,如 PRRSV、poliovirus, phage出芽释放(budding):与细胞内吞过程相反。常见于有囊膜的病毒。空泡释放(vacuolating):病毒粒子在细胞质内的空泡中聚集,病毒空泡再向细胞膜移动,并通过接触胞膜而破裂,病毒粒子释放到胞外。见于无囊膜的病毒由细胞间桥或融合细胞传播通过胞间连丝(植物病毒)不同病毒生物合成和装配的场所不同大多数DNA病毒,如疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒在胞核内合成DNA,装配过程亦在胞
23、核 中进行。DNA病毒中的痘病毒、虹彩病毒和非洲猪瘟病毒在胞浆内合成病毒DNA,其装配也在胞浆内 完成。大多数RNA病毒(流感病毒除外)在胞浆内增殖。病毒的异常复制(流产感染):病毒在感染细胞内合成了部分或全部的病毒成分,但不能 正常装配,或仅产生无感染性的子代病毒粒子的现象。 流产感染的类型:依赖于细胞的流产感染依赖于病毒的流产感染1 .依赖于细胞的流产感染原因:由病毒感染非允许细胞引起允许/非允许细胞是相对于某一特定病毒而言的。如:猴肾细胞为SV40的允许细胞, adenovi rus的非允许细胞发生机制细胞缺乏以下一种或几种成份病毒核酸复制所需的酶病毒晚期基因表达所需的酶病毒装配释放所需
24、的酶参与病毒成分转运、活化、装配的细胞因子有囊膜病毒不能正常获得囊膜2 .依赖于病毒的流产感染由缺损病毒引起缺损病毒的种类:干扰缺损病毒/颗粒(defective interfering virus/particle, DI 颗粒)DI颗粒的特点:基因组缺损(亚基因组)依赖于同源的标准病毒复制干扰同源的标准病毒的复制具有与亲代病毒相同的对称形式、形态特征、结构蛋白和抗原性DI颗粒至少保留亲代病毒基因组的:a)特异性的病毒复制酶的起始序列b)病毒壳体化的起始识别序列DI颗粒的产生DNA病毒:DNA复制错误、转座子跳跃、同源重组等RNA病毒:模板转换(RNA复制酶带着未合成好的新生链脱离模板,然后
25、重新结合新的模板 或原模板的新位点继续合成新生RNA链)。避免DI颗粒污染病毒制备物的方法用低感染复数(m.o. i)接种病毒和传代对种子病毒进行克隆纯化(蚀斑纯化)卫星病毒(satel I ite virus)特点:缺损基因组(存在于自然界的绝对缺损病毒,不是辅助病毒的缺损病毒)复制专一性地依赖于辅助病毒卫星病毒和辅助病毒的基因组无同源性Examples:腺联病毒(adneo-associated virus, AAV)与腺病毒8肝炎病毒(hepatitis delta virus, HDV)与乙型肝炎病毒(HBV)卫星烟草坏死病毒(satellite tobacco necrosis vi
26、rus, STNV)与 TNV大肠杆菌噬菌体P4与P2件缺损病毒(conditional defective virus)假病毒体(pseudov i r i on)假病毒体(伪装性缺损病毒):指具有病毒衣克及完莹外表,但衣党内的病毒核酸被细腹理 性的核酸完全所取代的趺披病毒。至栗见1亍多瘴病毒和噬菌体。假型病毒(pseudo-type virus):在病毒混合感染时,一种病毒的基因组被装配在另一种病 毒编码的衣壳或囊膜里而形成的病毒粒子。病毒的拯救(viral rescue):使处于流产感染中的病毒完成复制周期并产生感染性病毒粒子的过程或方法。方法协同培养(co-cultivation)协同
27、感染(co-infection)思考题1 .病毒的复制周期包括哪几个阶段?2 .为什么在接种病毒时要吸附一段时间?3 .对于一个特定的病毒而言,往往有一定的宿主细胞范围,这是为什么?4 .什么叫吸附?病毒的吸附分为哪几个阶段?处于这两个阶段的病毒有什么区别?5 .缺损病毒主要有哪几种?它们之间的区别何在?6 .各种病毒的增殖场所有什么不同?7 .动物病毒侵入细胞的方式有哪几种?8 .细胞膜、细胞浆和细胞核在病毒的增殖过程中各有什么意义?9 .病毒拯救的概念与方法。10 .细胞的长期冻存与复苏要遵循什么样的原则?具体如何操作?11 .病毒的培养方法主要有哪几种?第五章病毒的遗传与变异条件致死突变
28、株(conditional lethal mutant)在非允许条件(实验者所规定的条件)下不能繁殖,但在允许条件下能够繁殖,而相应的野 生型在这两种条件下都能繁殖。温敏突变体:冷适应突变株作用:获得弱毒株宿主范围突变株(host range mutant)与野生型相比,宿主范围有所改变。适应新宿主的突变体:特点:对原宿主毒力减弱,对新宿主的毒力逐渐增强生物学意义:获得弱毒株。利用实验动物代替本动物进行病毒学研究。利用细胞代替原宿主或实验动物进行病毒学研究。跨种感染/跨种传播(禽流感、SARS)蚀斑或痘斑或噬斑突变株(plaque morphology mutant)病毒蚀斑(空斑):病毒在已
29、长成的单层细胞上形成的局限性病灶。毒力突变株(virulence mutant)vaccine development pathogenesis抗原突变株(antigen mutant)流感病毒、口蹄疫病毒易发生抗原变异猪瘟病毒、牛瘟病毒还未发现有明显的抗原差异抗药性突变株(drug resistance mutant)抗病毒药物:病毒理、金刚烷胺、吗咻双胭、碘甘、阿昔洛韦、5-澳脱氧尿哓咤核普。同变体(共变体)多种表型同时改变的突变株回复突变体(revertant)病毒突变体通过某些途径回复到野生型表型,这种突变体称回复突变体。发生回复突变的3种途径:在原来突变的核甘酸上发生回复突变,恢复野
30、生型病毒的核昔酸序列(真正的回复突变)在原来突变基因上的另一个位点发生突变,使突变体恢复到野生型表型(基因内阻抑)在原来突变基因外的另一个基因上发生突变,产生野生型病毒表型(基因外阻抑)o基因重组Recombination由于两个或两个以上的病毒颗粒共同感染同一细胞时所发生的遗传物质的交换。病毒的重组机制分子内重组 拷贝选择重组 基因重配1 .分子内重组(intra-molecular recombination)发生于单一分子基因组的DNA或RNA病毒中病毒核酸分子断裂后与其它核酸分子发生再连接(病毒的交配)。2 .拷贝选择重组 copy-choice recombination发生在部分具
31、单一分子基因组RNA病毒中。仍属于分子内重组,但它不涉及核酸分子的共价键断裂,RNA聚合酶选择性地连接到静止模 板链上进行RNA子代链的合成。3 .基因重配(Genetic reassortment)发生于具有分段基因组的RNA病毒中分段基因组病毒之间核酸片段交换,基因组各片段在子代病毒中随机分配。病毒基因重组发生的对象活病毒间病毒与细胞之间灭活病毒与活病毒(两者不同但相关)之间重组在兽医学研究中的应用构建重组病毒:获得弱毒株或标记毒株用于疫苗生产遗传变异意义:变异使病毒逃逸免疫监视造成疾病流行。变异给抗病毒治疗造成困难。变异改变了病毒抗原(抗体)造成检测的困难。变异改变了病毒的毒力可获得减毒
32、疫苗。19世纪80年代,Paster对Rabies virus野毒(街毒)连续传代,获得了有效、遗传稳定 的狂犬减毒疫苗(固定毒)我国研制的猪瘟减毒活疫苗、马传贫减毒活疫苗干扰素介导的干扰干扰素的发现1957年,I saacs和Lindermann将吸附有灭活的流感病毒的鸡胚绒毛尿囊膜加入培养 继续培养,上清液具有抗流感病毒的作用。被刺激的细胞分泌了至少一种可溶性、能够干扰病毒繁殖的细胞因子。干扰素的性质:是一组由多种细胞在适宜诱生剂的作用下产生的具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和维持细胞 自身稳定等多种生物活性的糖蛋白,是一种重要的细胞因子。干扰素抗病毒作用的机制IFN与细胞表面的受体(含神经节
33、昔脂)结合,激活干扰素刺激基因(IFN-stimulating genes, ISG),产生多种抗病毒蛋白(antiviral protein, AVP)(主要是一些酶):如蛋白激酶(PKR)、 2 -5寡聚腺昔合成酶(0AS)、磷酸二酯酶等。干扰素抗病毒作用的特点-无直接杀病毒作用-广谱-相对的种属特异性-不同病毒的敏感性不同不可遗传性变异机制:A.不同的病毒具有相同的细胞受体。e.g腺病毒2型与柯萨奇病毒B3B.病毒阻断宿主细胞和其它病毒mRNA的翻译e. g.脊髓灰质炎病毒对水泡性口炎病毒繁殖的抑制。不可遗传性变异C.某些病毒的核酸能与先感染的病毒所合成的复制酶结合形成无活性的复合物。e
34、.g新城疫病毒(NDV)在其它的RNA病毒(如辛德华毕斯病毒)预先感染的细胞内不能 复制。思考题什么叫突变体?病毒的突变体有哪几种?其中哪些突变体比较有用?为什么?什么是表型混合?包括哪几种?病毒基因重组的机制与类型?病毒感染时发生干扰的机制有哪些?病毒的突变分为哪几种?复感染复活?交叉感染复活?什么是干扰素?干扰素抗病毒作用的特点与机制如何?第六章病毒感染与防制病毒感染细胞的类型根据病毒感染后细胞的表现不同分为:溶(杀)细胞性感染稳定态感染整合感染杀(溶)细胞性感染细胞在病毒感染以后,因代谢障碍而迅速死亡(破裂或溶解),大量感染性病毒释出于细胞 外的体液中,形成新一轮感染。主要由无包膜、杀伤
35、性强的病毒感染引起,如:痘病毒、小RNA病毒。稳定态感染病毒感染细胞后,病毒在细胞内增殖,但并不严重影响细胞的生命活动,被感染细胞能正常 繁殖。病毒常以出芽的方式释放或呈细胞到细胞的传播,如:PCV、CSFV、EB病毒、鼠类 的白血病病毒整合性感染病毒感染细胞后,病毒核酸整合于细胞染色体内,并随细胞的分裂而增殖,使细胞转化或恶 性变。腺病毒、SV40等在容许细胞内产生溶细胞感染而在非容许细胞内形成整合性感染 HIV先将病毒基因组RNA反转录成双链DNA,并整合到宿主细胞基因组上 病毒感染对细胞的影响1 .细胞裂解(死亡)对细胞大分子合成的抑制(RNA转录、mRNA加工、蛋白质合成、DNA合成)
36、病毒粒子或病毒物质的毒性作用2 .细胞溶酶体改变溶酶体渗透性可逆的增加:溶酶体不释放 溶酶体不可逆的损伤:溶酣体释放,溶细胞3,包涵(含)体形成(inclusion body)细胞被病毒感染以后,在细胞浆或细胞核内出现的一些在光学显微镜下可见的特殊结构。包涵体的实质(组成)病毒体或病毒组分:腺病毒、痘病毒、麻疹病毒细胞的退行性产物:疱疹病毒。某些细菌及其毒素、某些化学药物和重金属盐也可引起细胞类似的组织学变化。包涵体的类型不同病毒感染所形成的包涵体的形态、染色特性和存在部位各不相同:痘苗病毒:胞浆内嗜酸性包涵体单纯疱疹病毒:核内嗜酸性包涵体,细胞融合形成合胞体呼肠孤病毒:胞浆内核周嗜酸性包涵体
37、腺病毒:核内嗜碱性包涵体狂犬病病毒:胞浆内嗜酸性包涵体麻疹病毒:核内和胞浆内嗜酸性包涵体细胞融合:两个或两个以上细胞之间膜结合后出现多核细胞的现象。合胞体:细胞融合产生的同一细胞质内含有数个细胞核的融合细胞。能够引起细胞融合的病毒:副粘病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、禽传染性支气管炎病毒、逆转 录病毒科的维斯纳病毒等外源性融合(fusion from without) 即从外部融合,病毒以高感染复数感染时,由病毒表面 具有细胞融合活性的糖蛋白,引起未受病毒感染细胞之间的融合。特点:不需要病毒的复制。 内源性融合(fusion from within) 即从内部融合,是感染性病毒在其复制循环晚期,病
38、毒复制产生的有细胞融合活性的糖蛋白插入受染细胞的细胞质膜,受染细胞从而获得了融合 细胞的能力,结果导致受染细胞之间或受染细胞与未受感染细胞之间发生融合。病毒以外的融合剂:聚乙二醇山梨糖醇溶血卵磷脂刀豆球蛋白病毒导致红细胞凝集病毒的血凝素与红细胞表面的粘蛋白受体发生结合,导致形成红细胞-病毒-红细胞复合体。 (正粘病毒、副粘病毒)细胞转化为细胞的生物化学或生长特征的变化转化细胞与正常细胞的区别:无限增殖,成为永生化细胞 接触抑制现象丧失 细胞形态异常、染色体变型产生新的膜抗原对生长因子需要量降低转化细胞有可能在动物体内引起肿瘤接触性抑制:正常细胞与相邻细胞接触时,细胞运动停止,细胞分裂也被抑制的
39、现象。细胞凋亡多细胞生物的一种由基因控制的细胞自主性死亡过程,由细胞内部和外部刺激 诱导所致。特点:细胞变圆;胞浆浓缩;核染色质聚集、分块、位于核膜上;核仁裂解,核固缩,形成 凋亡小体:细胞核内的DNA被核酸内切酶降解为约180-200bp整数倍的核酸片段,凝胶电 泳图谱呈梯状(DNAladder)。细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整,一直到形成凋亡小体 破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小 肿胀变大凋亡小体有,被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无,细胞自溶,残
40、余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解,电泳图谱呈梯状随机降解,电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无,不释放细胞内容物 有,释放内容物。结局:DNA降解,细胞死亡。作用:维持机体的正常发育和新陈代谢凋亡异常:疾病可诱导性:治疗肿瘤感染性的病毒侵入敏感的宿主机体后,以繁殖形式或以非繁殖形式与机体相互作用所产生的 各种现象的总和,称为机体的病毒感染。构成机体病毒感染的因素病毒机体环境条件病毒病毒的质和量,是决定病毒感染和发病的重要因素。病毒的致病性:是病毒长期进化过程中形成的引起机体感染的潜在能力,是病毒“种”的特 征。毒力:某一特定毒株的致病性,是病毒“株”的特征
41、。病毒的数量:随病毒毒力和机体易感性的不同而异。病毒的感染途径和在体内的传播方式e.g乙型脑炎病毒:消化道感染不致病流感病毒:皮下注射时不致病病毒在细胞间的传播方式细胞外传播细胞间传播细胞亲-子代传播多种方式传播副粘病毒、疱疹病毒、;反转录病毒、动物机体非特异性抵抗力1.遗传因素2.年龄及生理状态 3.神经活动影响:发病率和症状的严重程度4.体温5.营养6.激素很多激素(特别是可的松制剂)有激发病毒感染的作用。如促肾上腺皮质激素(ACTH)能 够明显提高猴对脊髓灰质炎病毒以及小白鼠对流感病毒的敏感性。激素影响机体的机制:氢化可的松:抑制鸡胚、培养细胞和动物产生干扰素。可的松制剂:抗炎症和免疫抑
42、制。其他激素:可能因改变机体蛋白质代谢而增高其对病毒的易感性。外界环境条件气候:病毒的特性是喜冷怕热地理环境:如日本乙型脑炎,主要在亚洲国家发生;PRRSV的欧洲型和美洲型饲养管理方式:饲养密度、管理水平等机体病毒感染的类型和发生机制(-)按病程长短分:急性型亚急性型慢性型(持续性)(二)按症状明显程度分:显性感染隐性感染(三)按感染过程、症状和病理变化的主要发生部位:全身感染局部感染显性感染:病毒感染过程中机体呈现明显症状者。如:口蹄疫、猪瘟隐性感染:一切不引起临床症状的病毒感染。人与动物的某些腺病毒和肠道病毒感染。隐性感染的流行病学意义:(1)有成为传染源的可能(2)可使动物机体获得一定的
43、免疫力全身感染病毒侵入机体后,通过不同的途径进入机体的血液循环系统,随血流全身性扩散。 特点:都有病毒血症和病毒广泛分布于全身内脏器官的特征;呈现极不同的病理过程和临床 症状。不呈现任何临床症状:乙肝呈现局部症状:家兔的纤维瘤病毒感染呈现全身性症状: 猪瘟、牛瘟。局部感染病毒感染机体后,只存在于机体局部。皮肤感染:牛和兔的乳头状瘤病毒感染,只侵害表皮细胞呼吸道感染:人与动物的鼻病毒和某些副流感病毒消化道感染:鸡的腺病毒、猪传染性胃肠炎病毒神经系统感染:犬瘟热、新城疫引起脑炎。急性感染病毒感染机体后,潜伏期短,发病急,机体很快恢复健康或很快死亡。FMD、ND 持续性感染 指病毒感染机体后,病毒在
44、机体内持续存在,达数月或数年甚至终生但不一 定持续增殖或持续引起症状。持续性感染的特点:潜伏期长病原体长期存在病变和症状常与免疫病理或免疫缺陷有关,发病常呈进行性,预后大多不良。自然感染的宿主范围大多极窄,有遗传倾向持续性感染的分类慢性感染潜伏感染慢病毒感染慢性感染 病毒在机体内持续增殖,可不断排出体外,常不引起临床症状,但在机体免疫 功能低下时发病,症状长期存在。如:慢性猪瘟、小鼠乳酸脱氢酶增高症、人的乙肝、艾滋 病特点:不产生疾病,但有感染性病毒持续存在,如乙肝病毒的无症状健康带毒者。在后期可能由于免疫病理或肿瘤并发症而引起疾病,如马传染性贫血病毒、艾滋病、鼠类、 禽类和猫的白血病病毒。潜
45、伏感染 在急性或隐性感染之后,病毒潜伏存在于一定的组织细胞中,在某些条件下, 病毒在宿主细胞体内重新增殖和扩散,再次出现与初次感染症状极为相似或截然不同的急性 发作,而且以后还会反复发生。如:人的水痘-带状疱疹病毒、伪狂犬病毒。慢病毒感染(长程感染)指潜伏期长,发病呈慢性进行性且最后转归于死亡的一种病毒感染。与慢性感染的不同点:疾病过程缓慢,但不断发展而且无例外地死亡。引起慢病毒感染的病原体:常规病毒:如马传染性贫血病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、人的麻疹病毒、人和猴的免疫缺 陷病病毒。肮病毒:羊的痒疫、貂的传染性脑病、鹿的慢性消耗性疾病、牛的海绵状脑病、人的库鲁病 和克一雅氏病等。持续性感染发生的机制(1)病毒因素A、病毒基因组整合到宿主细胞DNA中。如:逆转录病毒、SV40B、病毒侵犯免疫细胞或在有掩护的部位或细胞内增殖。如a疱疹病毒、人和猴免疫缺陷病 毒侵入T4淋巴细胞。C、病毒抗原发生变异。马传染性贫血病毒D、干扰缺损颗粒(DI)的出现。水疱性炎病毒(VSV)E、病毒无免疫原性。肮病毒(2)机体方面A、免疫耐受机体在胚胎或初生期感染某些病毒,免疫组织或细胞再次接触该病毒抗原不产生抗体及细胞免疫,或仅有低反应性免疫应
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