质粒抽提实用.pptx
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1、质粒简介质粒简介质粒质粒(plasmid)(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复复 制和遗传的辅助性遗传单位。制和遗传的辅助性遗传单位。第1页/共55页ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA第2页/共55页 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工
2、质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值,而质粒的分离与提取则是最常用、具在基因工程中具有极广泛的应用价值,而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术最基本的实验技术 第3页/共55页质粒特性质粒特性1.1.分子相对小分子相对小 2.2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3.3.不相容性不相容性(incompatibility)(incompatibility)4.4.转移性转移性5.5.选择的标记选择的标记(selective markers)(selective markers)6.6.限制性内切酶单一切口限制性内
3、切酶单一切口第4页/共55页质粒的结构特点分子量相对较小 共价闭合分子 双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力超螺旋DNA分子 线性DNA分子 半开环DNA分子第5页/共55页Plasmidvectors第6页/共55页表达载体载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等Exprssion vector第7页/共55页细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 第8页/共55页质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 一、细菌的培养一、细菌的培养 (bacterial culture)(bacterial culture
4、)l l 先分离单个菌落,接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增,随着细菌的先分离单个菌落,接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增,随着细菌的生长,质粒生长,质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。第9页/共55页 对于松弛型质粒,由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制,故在细对于松弛型质粒,由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制,故在细菌对数生长后期,加入氯霉素(菌对数生长后期,加入氯霉素(chloromycetin)抑制宿主蛋白质的合成和染色抑制宿主蛋白质的合成和染色体体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量扩增的复制不受影响而大量扩增第10页/共
5、55页l所所以以使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的,是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下,减减少少细细菌菌的培养体积和细菌的数量的培养体积和细菌的数量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差,常常是是由由于于质质粒粒携携带带外外源源基基因因或或质质粒粒分分子量过大所致。子量过大所致。第11页/共55页二、细菌的收集二、细菌的收集(bacterial(bacterial collection)collection)细细胞胞生生长长过过程程中中,排排出出大大量量代代谢谢产产物物,为为了了提提高高质质粒粒DNADNA的的纯纯度度,离离心心弃弃上上清清,细细
6、菌菌沉沉淀淀最最好好用用STESTE或或生生理理盐盐水水悬悬浮浮,漂漂洗洗l-2l-2次次,离离心心管管壁壁上上的的液液体体也也应应该该仔仔细去除干净。细去除干净。第12页/共55页三、细菌裂解细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多,如如去去污污剂剂法法,沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法,有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法法等等。不不同同方方法法各各有有利利弊弊,一一般般要要根根据据质质粒粒性性质质、宿宿主主菌菌的的特特性性及及后后继继的的纯纯化化方方法法等等多多种种因因素素综合后加以选择综合后加以选择。第13页/共55页质粒提取的方法碱裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法
7、其他第14页/共55页质粒质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 l常常用用的的煮煮沸沸法法,碱碱法法,SDSSDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒,用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分分离离,只只是各个实验室的习惯问题是各个实验室的习惯问题.第15页/共55页l选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNADNA,应考虑以下因素:应考虑以下因素:1 1菌株类型(菌株类型(typetype)2 2质粒的大小质粒的大小(size)size)3 3细菌染色体细菌染
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