流式细胞仪检测凋亡和细胞周期精选PPT.ppt
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1、关于流式细胞仪检测凋亡和细胞周期第1页,讲稿共58张,创作于星期二什么是流式细胞仪流式细胞仪实物BD FACSVantageBD-Calibur 第2页,讲稿共58张,创作于星期二1.发展历史发展历史n n1934Moldavann n1973Steinkamp一、一、概述概述第3页,讲稿共58张,创作于星期二2.2.2.2.定定定定义义义义:对对对对在在在在高高高高速速速速流流流流动动动动的的的的鞘鞘鞘鞘液液液液包包包包括括括括下下下下对对对对特特特特异异异异荧荧荧荧光光光光标标标标记的细胞、粒子进行记的细胞、粒子进行记的细胞、粒子进行记的细胞、粒子进行分析和分选分析和分选分析和分选分析和分
2、选的技术的技术的技术的技术.3.3.3.3.特点特点特点特点uu测测测测量量量量速速速速度度度度快快快快,每每每每秒秒秒秒钟钟钟钟能能能能测测测测数数数数千千千千个个个个乃乃乃乃至至至至上上上上万万万万个个个个细细细细胞胞胞胞uu可进行多参数测量可进行多参数测量可进行多参数测量可进行多参数测量uu在在在在分分分分析析析析的的的的同同同同时时时时可可可可把把把把具具具具有有有有指指指指定定定定特特特特征征征征的的的的细细细细胞胞胞胞分分分分离离离离出出出出来来来来,即分选技术。即分选技术。即分选技术。即分选技术。第4页,讲稿共58张,创作于星期二凡凡凡凡是是是是能能能能被被被被荧荧荧荧光光光光素
3、素素素标标标标记记记记的的的的细细细细胞胞胞胞或或或或颗颗颗颗粒粒粒粒都都都都可可可可用用用用流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪检测。仪检测。仪检测。仪检测。前前前前提提提提这这这这种种种种荧荧荧荧光光光光素素素素能能能能被被被被流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪所所所所配配配配置置置置的的的的激激激激光光光光光光光光源源源源激发激发激发激发在在在在生生生生物物物物检检检检测测测测技技技技术术术术中中中中流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪是是是是不不不不可可可可多多多多得得得得的的的的一一一一机机机机多多多多用用用用的的的的仪器。仪器。仪器。仪器。4.应用范围应用范围第5页,讲稿共
4、58张,创作于星期二二、流式细胞仪的工作原理和基本结构二、流式细胞仪的工作原理和基本结构待待待待测测测测细细细细胞胞胞胞以以以以单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的悬悬悬悬液液液液,经经经经特特特特异异异异性性性性荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料染染染染色色色色,放放放放入入入入样样样样品品品品管管管管,吸吸吸吸入入入入流动室。流动室。流动室。流动室。流流流流动动动动室室室室充充充充满满满满鞘鞘鞘鞘液液液液,作作作作用用用用:约约约约束束束束样样样样品品品品在在在在喷喷喷喷嘴嘴嘴嘴中中中中心心心心,防防防防止止止止样样样样品品品品靠靠靠靠近近近近喷喷喷喷孔孔孔孔壁壁壁壁堵堵堵堵塞塞塞塞喷喷
5、喷喷孔孔孔孔。细细细细胞胞胞胞排排排排成成成成单单单单列列列列由由由由喷喷喷喷嘴嘴嘴嘴中中中中心心心心喷喷喷喷出出出出,形形形形成成成成细细细细胞液柱。胞液柱。胞液柱。胞液柱。液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光。液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析。荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析。第6页,讲稿共58张,创作于星期二第7页,讲稿共58张,创作于星期二基本结构基本结构n n流动室和液流系统;流动室和液流系统;流动室和液流系统;流动室和液流系统;n n激光源和光学系统;激光源和光学系统;激光源和光学系统;激光源和光学系统;
6、n n光电管和检测系统;光电管和检测系统;光电管和检测系统;光电管和检测系统;n n计算机和分析系统。计算机和分析系统。计算机和分析系统。计算机和分析系统。第8页,讲稿共58张,创作于星期二三、流式细胞仪可检测到的细胞参数n n非荧光信号非荧光信号颗粒度颗粒度细胞大小细胞大小n n前向角散射光(前向角散射光(前向角散射光(前向角散射光(FSCFSCFSCFSC)细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 n n侧向角散射光(侧向角散射光(侧向角散射光(侧向角散射光(SSCSSCSSCSSC)细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复细胞颗粒度及细胞内细胞器的
7、相对复细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性杂性杂性杂性第9页,讲稿共58张,创作于星期二血液涂片血液涂片第10页,讲稿共58张,创作于星期二外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图第11页,讲稿共58张,创作于星期二n n荧光信号荧光信号n n荧光强度(荧光强度(荧光强度(荧光强度(FLFL):细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光,不同):细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光,不同):细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光,不同):细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光,不同的荧光染料其发射波长不同。的荧光染料其发射波长不同。的荧光染
8、料其发射波长不同。的荧光染料其发射波长不同。uu有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来(阴阳)有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来(阴阳)有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来(阴阳)有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来(阴阳)uu高高高高FLFL细胞与低细胞与低细胞与低细胞与低FLFL细胞区分开来(强弱)细胞区分开来(强弱)细胞区分开来(强弱)细胞区分开来(强弱)n n一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(488nm488nm),可测出三个),可测出三个),可测出三个),可测出三个F
9、LFL,即,即,即,即FL1FL1、FL2FL2、FL3FL3,大型的流式细胞仪装有两个或三个激,大型的流式细胞仪装有两个或三个激,大型的流式细胞仪装有两个或三个激,大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源(光光源(光光源(光光源(488nm488nm、633nm633nm和和和和325nm325nm),可测出),可测出),可测出),可测出6 6个个个个FLFL。第12页,讲稿共58张,创作于星期二n n荧光信号与细胞特性荧光信号与细胞特性 荧光染料被激发而发射的光信号。荧光染料被激发而发射的光信号。定量染色定量染色 荧光信号大小荧光信号大小 被标记组分含量的定量被标记组分含量的定量 多荧光标记
10、胞内多种组分,实现多参数测量多荧光标记胞内多种组分,实现多参数测量第13页,讲稿共58张,创作于星期二二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光,荧光光信号分离,导向光信号分离,导向各探测通道接收并转化为电信号。各探测通道接收并转化为电信号。光信号收集光信号收集第14页,讲稿共58张,创作于星期二三三数据处理及数据处理及流式报告FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理,模数转换光信号电信号记录数据,显示结果(面积,峰高,宽度)第15页,讲稿共58张,创作于星期二n n流流流流式式式式报报报报告告告告的的的的
11、图图图图一一一一般般般般分分分分为为为为四四四四种种种种,即即即即散散散散点点点点图图图图、直直直直方方方方图图图图、密密密密度度度度图图图图和和和和二二二二维维维维等等等等高高高高图图图图等等等等。最最最最常常常常用用用用的的的的为为为为散散散散点点点点图图图图和和和和直直直直方图。方图。方图。方图。n n几个概念:几个概念:几个概念:几个概念:n n%Gated%Gated:阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。的数量。的数量。的数量。n nMeanMean:平均荧光强
12、度,与被检测物质的表达量有平均荧光强度,与被检测物质的表达量有平均荧光强度,与被检测物质的表达量有平均荧光强度,与被检测物质的表达量有关,在正态分布时一般用该值。关,在正态分布时一般用该值。关,在正态分布时一般用该值。关,在正态分布时一般用该值。n nGeoMeanGeoMean:几何平均荧光强度,在阳性细胞为偏态分几何平均荧光强度,在阳性细胞为偏态分几何平均荧光强度,在阳性细胞为偏态分几何平均荧光强度,在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。布时一般用该值。布时一般用该值。布时一般用该值。第16页,讲稿共58张,创作于星期二散点图 密度图二维等高图直方图图 报告中常见的几种流式细胞图第17页,讲稿
13、共58张,创作于星期二图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死第18页,讲稿共58张,创作于星期二流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=点图分析点图分析点图分析点图分析第19页,讲稿共58张,创作于星期二流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析=直方图分析直方图分析第20页,讲稿共58张,创作于星期二图中100101(M1)为阴性细胞,101以上的(M2)为阳性细胞 第21页,讲稿共58张,创作于星期二 五、流式细胞术的应用n n细胞结构细胞结构细胞结构细胞结构n n细胞大小细胞大小细胞大小细胞大小n n细胞颗粒度细胞颗粒度细胞颗粒度细胞颗粒度n n细胞表面积细胞表面积细胞表面积细胞表
14、面积n n核浆比例核浆比例核浆比例核浆比例n nDNADNA含量与细胞周含量与细胞周含量与细胞周含量与细胞周期期期期n nRNARNA含量含量含量含量n n蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量n n 细胞功能细胞功能细胞功能细胞功能n n细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面/胞浆胞浆胞浆胞浆/核的特异性抗原核的特异性抗原核的特异性抗原核的特异性抗原n n细胞活性细胞活性细胞活性细胞活性n n细胞内细胞内细胞内细胞内/外的细胞因子外的细胞因子外的细胞因子外的细胞因子n n激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体n n蛋白磷酸化蛋白磷酸化蛋白磷酸化蛋
15、白磷酸化n npHpHpHpH值值值值n n钙离子浓度钙离子浓度钙离子浓度钙离子浓度n n细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 第22页,讲稿共58张,创作于星期二一)一)细胞细胞DNA含量检测含量检测细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用细胞固定后用PIPI(Propidiumiodide碘化丙啶),碘化丙啶),染色,染色,染色,染色,因为因为因为因为PIPI特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞特异性结合于细胞DNADNA,荧光强度与,荧光强度与,荧光强度与,荧光强度与PIPI的结合的结合的结合的结合量呈良好的线性关系,根
16、据这个原理,可测出细胞量呈良好的线性关系,根据这个原理,可测出细胞量呈良好的线性关系,根据这个原理,可测出细胞量呈良好的线性关系,根据这个原理,可测出细胞的的的的DNADNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。检测。检测。检测。第23页,讲稿共58张,创作于星期二第24页,讲稿共58张,创作于星期二单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞,4N代表G2/M期细胞,两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 第25页,讲稿共58张,创作于星期二DNA细胞
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