组织培养与植物转基因.pptx
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1、1u植物基因工程发展迅速。自从植物基因工程发展迅速。自从19831983年年首例转基因植物(烟草)诞生以来,首例转基因植物(烟草)诞生以来,现在已有现在已有100100多种植物通过基因工程技多种植物通过基因工程技术获得了转基因植株,包括术获得了转基因植株,包括番茄、辣番茄、辣椒、茄子、马铃薯、胡萝卜、芹菜、椒、茄子、马铃薯、胡萝卜、芹菜、莴苣、甜瓜、黄瓜、白菜、甘蓝、花莴苣、甜瓜、黄瓜、白菜、甘蓝、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋葱、柑橘、椰菜、芥菜、石刁柏、洋葱、柑橘、柿、杨树、桉树柿、杨树、桉树等。等。第1页/共44页22 植物基因工程的载体植物基因工程的载体uTi载体载体u其它载体其它载体 RN
2、Ai 第2页/共44页3u根癌农杆菌(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的)的Ti质粒(质粒(Tumor-inducing plasmid)的改建与利用,的改建与利用,从而开创了植物基因工程的新纪元。从而开创了植物基因工程的新纪元。根癌农杆菌根癌农杆菌第3页/共44页4第4页/共44页5第5页/共44页6第6页/共44页7TDNA第7页/共44页8u植物基因工程中,我们把接受外源植物基因工程中,我们把接受外源植物基因工程中,我们把接受外源植物基因工程中,我们把接受外源(目的目的目的目的)基因的生命基因的生命基因的生命基因的生命体系称为体系称为体系称为体系称为“受体
3、受体受体受体”。u受体包括:受体包括:受体包括:受体包括:叶圆片叶圆片叶圆片叶圆片(盘盘盘盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组、胚性愈伤、胚状体、愈伤组、胚性愈伤、胚状体、愈伤组、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。u其基本形态还是细胞。其基本形态还是细胞。其基本形态还是细胞。其基本形态还是细胞。u叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法;愈伤叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法;愈伤叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法;愈伤叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法;愈
4、伤组织的转化效率高、生长速度快,是快速检测外源组织的转化效率高、生长速度快,是快速检测外源组织的转化效率高、生长速度快,是快速检测外源组织的转化效率高、生长速度快,是快速检测外源基因表达的最好受体;原生质体则是单克隆转化的基因表达的最好受体;原生质体则是单克隆转化的基因表达的最好受体;原生质体则是单克隆转化的基因表达的最好受体;原生质体则是单克隆转化的最佳材料。最佳材料。最佳材料。最佳材料。3 植物基因转化的受体植物基因转化的受体第8页/共44页9转化植株转化植株转化植株转化植株(未)受精卵细胞未)受精卵细胞花粉花粉胚胚胚轴胚轴子叶子叶叶片叶片茎段茎段萌发种子萌发种子子房子房原生质体原生质体悬
5、浮培养细胞悬浮培养细胞花器官花器官根根创伤植株创伤植株块茎块茎茎尖茎尖植物基因转化的外植体植物基因转化的外植体第9页/共44页10u被转化的受体细胞是单个独立的被转化的受体细胞是单个独立的细胞,为选择遗传均一性的转基细胞,为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。因植株提供了可能性。u以悬浮细胞作受体的转化方法包以悬浮细胞作受体的转化方法包括:括:农杆菌介导法、基因枪法、农杆菌介导法、基因枪法、PEGPEG介导法、电激法和显微注射介导法、电激法和显微注射法等。法等。3.1 悬浮细胞悬浮细胞第10页/共44页11u原生质体是无细胞壁的细胞。原生质体是无细胞壁的细胞。u与悬浮细胞一样,被转化的受与
6、悬浮细胞一样,被转化的受体细胞是单个独立的细胞,为体细胞是单个独立的细胞,为选择遗传均一性的转基因植株选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。提供了可能性。3.2 原生质体原生质体第11页/共44页12u愈伤组织容易大量制备愈伤组织容易大量制备u愈伤组织的转化已在玉米、甘愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。蔗、芹菜等植物上获得成功。u用农杆菌介导法最适合。用农杆菌介导法最适合。3.3 胚性愈伤组织胚性愈伤组织第12页/共44页13u胚状体是由愈伤组织经过改胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的,其转化方法造后分化而来的,其转化方法与愈伤组织相同。与愈伤组织相同。3.4 胚状体胚
7、状体第13页/共44页14u叶圆片是农杆菌转化的主要受体。叶圆片是农杆菌转化的主要受体。也也称为叶盘法。称为叶盘法。l用打孔器或解剖刀切取直径用打孔器或解剖刀切取直径用打孔器或解剖刀切取直径用打孔器或解剖刀切取直径35353535mmmmmmmm的叶圆片;的叶圆片;的叶圆片;的叶圆片;l在液体培养瓶中与农杆菌共培养在液体培养瓶中与农杆菌共培养在液体培养瓶中与农杆菌共培养在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-3020-3020-3020-30minminminmin;l将叶圆片在滤纸上吸干;将叶圆片在滤纸上吸干;将叶圆片在滤纸上吸干;将叶圆片在滤纸上吸干;l转移到非选择性培养基上培养转移到非选择性培
8、养基上培养转移到非选择性培养基上培养转移到非选择性培养基上培养3 3 3 3d d d d;l再移入含抗生素的选择培养基上培养;再移入含抗生素的选择培养基上培养;再移入含抗生素的选择培养基上培养;再移入含抗生素的选择培养基上培养;l诱导植株再生;诱导植株再生;诱导植株再生;诱导植株再生;l获得转基因植株。获得转基因植株。获得转基因植株。获得转基因植株。u叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化。叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化。3.5 叶圆片叶圆片第14页/共44页15u如子叶、胚轴、茎段、根、如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等体细胞胚、花粉等3.6 其他受体其他受体第15页/共44页16u农杆
9、菌介导法农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated transformation)u基因枪转化法基因枪转化法(Microprojectile bombardment)u聚乙二醇聚乙二醇-介导法介导法(PEG-mediated transfomation)u电激法电激法(Electroporation)u花粉管通道法花粉管通道法(Pollen-tubepathway)u显微注射法显微注射法(Microinjection)u 脂质体转化脂质体转化(Liposomes transformation)u激光微束转化法激光微束转化法(Laser microbeam puncture)4
10、植物基因转化的方法植物基因转化的方法第16页/共44页17u根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)介导法介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。u其其Ti质粒质粒(Tumor-inducing plasmid)具有将具有将DNA整整合到植物染色体上,并使之与植物内源基因合到植物染色体上,并使之与植物内源基因同步表达的能力。同步表达的能力。u每个每个Ti质粒都有质粒都有3个功能区域。一是个功能区域。一是T-DNA区,区,即转化即转化DNA区,与病症发生有关的基因位于这区,与病症发生有关的基因位于这个区,决定着肿瘤形态
11、和冠瘿碱的合成;二个区,决定着肿瘤形态和冠瘿碱的合成;二是是Vir区,是区,是T-DNA区以外的与感染肿瘤有关的区以外的与感染肿瘤有关的区域;三是分解和利用冠瘿碱的区域,分布区域;三是分解和利用冠瘿碱的区域,分布着冠瘿碱分解酶基因。着冠瘿碱分解酶基因。4.1 农杆菌介导法农杆菌介导法第17页/共44页184.2 微弹轰击法微弹轰击法u原理:原理:金属微粒在外力作用下达到一定速度后,可以进入植物细胞,但又不引金属微粒在外力作用下达到一定速度后,可以进入植物细胞,但又不引起细胞致命伤害,仍能维持正常的生命活动。起细胞致命伤害,仍能维持正常的生命活动。也称为基因枪法。也称为基因枪法。u利用这一特性,
12、先将含目的基因的外源利用这一特性,先将含目的基因的外源DNADNA同钨、金等金属微粒混匀,使同钨、金等金属微粒混匀,使DNADNA吸附在金属微粒表面,随后用基因枪轰击,使吸附在金属微粒表面,随后用基因枪轰击,使DNADNA随高速金属微粒进入植物细随高速金属微粒进入植物细胞。胞。u此方法可直接处理植物某器官或某组织,是当今普遍使用的植物转基因方法。此方法可直接处理植物某器官或某组织,是当今普遍使用的植物转基因方法。第18页/共44页19第19页/共44页20u聚乙二醇介导法与聚乙二醇介导法与PEGPEG诱导原生质体融合诱导原生质体融合的机理相似,不同的是后者发生在原生质的机理相似,不同的是后者发
13、生在原生质体之间,而前者发生在原生质体与体之间,而前者发生在原生质体与DNADNA之之间。间。u在高浓度的二价钙离子在高浓度的二价钙离子(CaCa2+2+)和高和高pHpH值的值的条件下,略带负电的高分子条件下,略带负电的高分子PEGPEG可能促进可能促进DNADNA向原生质体膜沉淀,或参与原生质体向原生质体膜沉淀,或参与原生质体的内吞作用下,使外源的内吞作用下,使外源DNADNA分子进入原生分子进入原生质体和细胞核,并整合到染色体上。质体和细胞核,并整合到染色体上。4.3 聚乙二醇聚乙二醇-介导法介导法第20页/共44页214.4 电激法电激法 u原理:原理:原理:原理:细胞膜的基本组成是磷
14、脂,在适当的外加脉细胞膜的基本组成是磷脂,在适当的外加脉细胞膜的基本组成是磷脂,在适当的外加脉细胞膜的基本组成是磷脂,在适当的外加脉冲电场作用下,细胞膜被击穿,但还达不到细胞致冲电场作用下,细胞膜被击穿,但还达不到细胞致冲电场作用下,细胞膜被击穿,但还达不到细胞致冲电场作用下,细胞膜被击穿,但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后,被击穿的膜孔可命伤害。所以当移去外加电场后,被击穿的膜孔可命伤害。所以当移去外加电场后,被击穿的膜孔可命伤害。所以当移去外加电场后,被击穿的膜孔可自行复原。自行复原。自行复原。自行复原。也称为电穿孔法。也称为电穿孔法。也称为电穿孔法。也称为电穿孔法。u根据这一性
15、质,植物原生质体同外源根据这一性质,植物原生质体同外源根据这一性质,植物原生质体同外源根据这一性质,植物原生质体同外源DNADNADNADNA分子混合,分子混合,分子混合,分子混合,置于电击仪的样品室中,按预定的参数进行直流电置于电击仪的样品室中,按预定的参数进行直流电置于电击仪的样品室中,按预定的参数进行直流电置于电击仪的样品室中,按预定的参数进行直流电脉冲处理,再通过常规的再分化培养和筛选,可获脉冲处理,再通过常规的再分化培养和筛选,可获脉冲处理,再通过常规的再分化培养和筛选,可获脉冲处理,再通过常规的再分化培养和筛选,可获得转基因植株。得转基因植株。得转基因植株。得转基因植株。u为避免制
16、备原生质体和原生质体再生植株的困难,为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难,为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难,为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难,近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、愈伤组织和花粉粒,均取得一定的效果。愈伤组织和花粉粒,均取得一定的效果。愈伤组织和花粉粒,均取得一定的效果。愈伤组织和花粉粒,均取得一定的效果。第21页/共44页22第22页/共44页23第23页/共44页244.5 花粉管通道法花粉管通道法u原理
17、:原理:将重组将重组DNADNA涂于授粉的柱头涂于授粉的柱头上,使上,使DNADNA沿花粉管通道或传递组沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊,转化尚不具织通过珠心进入胚囊,转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞,在活体内产生转基因种胚胎细胞,在活体内产生转基因种子。子。第24页/共44页25花粉管通道法第25页/共44页264.6 显微注射法显微注射法u原理:原理:利用显微注射仪将外源利用显微注射仪将外源DNADNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。直接注入受体的细胞质或细胞核中。u重要问题:必须把受体细胞进行固定。重要问题:必须把受体细胞进行固定。u动
18、物细胞具有独特的贴壁生长待性,因此不存在固定细胞的问题。动物细胞具有独特的贴壁生长待性,因此不存在固定细胞的问题。u植物细胞的显微注射必须建立固定细胞技术。目前有三种方法:植物细胞的显微注射必须建立固定细胞技术。目前有三种方法:琼脂糖(低熔琼脂糖(低熔点)包埋法;点)包埋法;多聚多聚-L-L-赖氨酸粘连法;赖氨酸粘连法;吸管(毛细管)支持法。吸管(毛细管)支持法。第26页/共44页274.7 脂质体介导法脂质体介导法u原理:原理:脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构,把用来转染的脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构,把用来转染的DNADNA分子包在分子包在其中,通过脂质体与
19、细胞接触,将外源其中,通过脂质体与细胞接触,将外源DNADNA导人受体细胞。导人受体细胞。u包装成脂质体的包装成脂质体的DNADNA的转染串比裸露的的转染串比裸露的DNADNA的转染率高出的转染率高出100100倍。倍。u如先用如先用PEGPEG处理培养处理培养的受体细胞,使其易吸收培养基中的脂质体,可提高转染率的受体细胞,使其易吸收培养基中的脂质体,可提高转染率10201020倍。倍。u在正常情况下,每个细胞平均可吸收在正常情况下,每个细胞平均可吸收10001000个左右的脂质体。个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。用的方法之一。第27页/共44
20、页284.8 激光微束穿孔法激光微束穿孔法u原理:原理:利用直径很小(纳米级)、利用直径很小(纳米级)、能量很高的激光微束可引起细胞膜可能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理,在荧光显微镜下用逆性穿孔的原理,在荧光显微镜下用激光处理细胞,处于细胞周围的重组激光处理细胞,处于细胞周围的重组DNADNA随之进入细胞。随之进入细胞。u此方法最适用于此方法最适用于活细胞中线粒体和活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。叶绿体等细胞器的基因转移。第28页/共44页29第29页/共44页30植株再生是基因转移的关键步骤,直接决定能否获得转植株再生是基因转移的关键步骤,直接决定能否获得转植株再生是
21、基因转移的关键步骤,直接决定能否获得转植株再生是基因转移的关键步骤,直接决定能否获得转基因植株。基因植株。基因植株。基因植株。1.1.两种形式:两种形式:两种形式:两种形式:一种是愈伤组织再生一种是愈伤组织再生一种是愈伤组织再生一种是愈伤组织再生另一种是直接再生,从外植体直接诱导出芽而不另一种是直接再生,从外植体直接诱导出芽而不另一种是直接再生,从外植体直接诱导出芽而不另一种是直接再生,从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。经过愈伤组织的分化。经过愈伤组织的分化。经过愈伤组织的分化。2.2.转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同,转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同,转墓因
22、植株再生的方式与一般植株再生的方式相同,转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同,主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、抗生素、转化过程的影响。抗生素、转化过程的影响。抗生素、转化过程的影响。抗生素、转化过程的影响。5 转基因植株的再生及其检测方法转基因植株的再生及其检测方法5.1 5.1 转基因植株再生转基因植株再生第30页/共44页31u常采用报告基因作为标记,以便快速检测。常采用报告基因作为标记,以便快速检测。u主要采用分子生物学方
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- 组织培养 植物 转基因
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