DNA的重组与转座培训教材44440.pptx
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1、 第第 6 章章 DNA的重组与转座的重组与转座 Chapter 6 DNA Recombinant and Transposition2013.10.292013.10.291、通常、通常DNA自发变化都是通过自发变化都是通过 作用很快作用很快 被校正,但在极少情况下,被校正,但在极少情况下,DNA将变化的部分保将变化的部分保 留下来导致永久的序列变化,称为:留下来导致永久的序列变化,称为:。2、DNA复制过程中发生的复制过程中发生的DNA变化称为变化称为 。损伤的修复方式有损伤的修复方式有 ;,其中以其中以 为主。为主。填填 空空DNA修复修复突变突变损伤损伤错配修复错配修复 直接修复直接
2、修复 切除修复切除修复重组修复重组修复SOS系统系统切除修复切除修复1、紫外线照射对、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是分子的损伤主要是:()A.碱基替换;碱基替换;B.磷酸酯键断裂;磷酸酯键断裂;C.碱基丢失;碱基丢失;D.形成共价连接的嘧啶二聚体。形成共价连接的嘧啶二聚体。选选 择择D2、比较真核生物与原核生物的、比较真核生物与原核生物的DNA复制复制,二二 者的相同之处是:者的相同之处是:()A.引物长度较短;引物长度较短;B.合成方向是合成方向是53;C.冈崎片段长度短;冈崎片段长度短;D.有多个复制起始点;有多个复制起始点;E.DNA复制的速度较慢复制的速度较慢(50dNTP/s).
3、B3、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病,患患 者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌,该病的该病的分子机理是:分子机理是:()A.细胞膜通透性缺陷引起迅速失水细胞膜通透性缺陷引起迅速失水;B.在阳光下使温度敏感性转移酶类失活在阳光下使温度敏感性转移酶类失活;C.因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒;D.细胞不能合成类胡萝卜素型化合物细胞不能合成类胡萝卜素型化合物;E.DNA修复系统有缺陷。修复系统有缺陷。E66.1 6.1 同源重组同源重组同源重组同源重组6.1.1 6.1.1 同源重组的分子模型同
4、源重组的分子模型同源重组的分子模型同源重组的分子模型6.1.2 6.1.2 异源双链与基因转换异源双链与基因转换异源双链与基因转换异源双链与基因转换6.1.3 6.1.3 细菌基因转移与重组细菌基因转移与重组细菌基因转移与重组细菌基因转移与重组6.1.3.1 6.1.3.1 细菌的接合作用细菌的接合作用细菌的接合作用细菌的接合作用6.1.3.2 6.1.3.2 遗传转化遗传转化遗传转化遗传转化6.1.3.3 6.1.3.3 细菌的转导细菌的转导细菌的转导细菌的转导6.1.3.4 6.1.3.4 细菌的细胞融合细菌的细胞融合细菌的细胞融合细菌的细胞融合6.2 DNA6.2 DNA重组技术重组技术
5、重组技术重组技术6.3 6.3 特异位点重组特异位点重组特异位点重组特异位点重组6.3.16.3.1噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA整合与整合与整合与整合与 切除切除切除切除6.3.2 6.3.2 细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组6.4 DNA6.4 DNA的转座的转座的转座的转座6.4.1 6.4.1 转座子的概念转座子的概念转座子的概念转座子的概念6.4.2 6.4.2 转座子的分类转座子的分类转座子的分类转座子的分类6.4.2.1 6.4.2.1 插入序列插入序列插入序列插入序列(IS(IS因子因子因子因子)6.4.2.2 6.4.2.2 复合
6、转座子复合转座子复合转座子复合转座子(Tn)(Tn)6.4.3 6.4.3 转座子转座的机制转座子转座的机制转座子转座的机制转座子转座的机制 6.4.4 6.4.4 转座子转座的特征转座子转座的特征转座子转座的特征转座子转座的特征6.4.5 6.4.5 转座引起遗传学效应转座引起遗传学效应转座引起遗传学效应转座引起遗传学效应6.4.6 6.4.6 真核生物的转座因子真核生物的转座因子真核生物的转座因子真核生物的转座因子6.5 6.5 逆转录转座子逆转录转座子逆转录转座子逆转录转座子6.4.16.4.1逆转座子的结构特点逆转座子的结构特点逆转座子的结构特点逆转座子的结构特点6.4.26.4.2逆
7、转座子的作用机制逆转座子的作用机制逆转座子的作用机制逆转座子的作用机制6.4.36.4.3逆转座子的生物学意义逆转座子的生物学意义逆转座子的生物学意义逆转座子的生物学意义第六章第六章 DNA的重组与转座的重组与转座7n重组的概念重组的概念重组的概念重组的概念:DNA DNA分子分子分子分子内或间发生遗传信息的重新组合,内或间发生遗传信息的重新组合,内或间发生遗传信息的重新组合,内或间发生遗传信息的重新组合,称称称称遗传重组遗传重组遗传重组遗传重组(染色体水平)或(染色体水平)或(染色体水平)或(染色体水平)或基因重排基因重排基因重排基因重排(分子水平分子水平分子水平分子水平)。重组产物称为重组
8、产物称为重组产物称为重组产物称为重组重组重组重组DNADNA(recombinant DNA)(recombinant DNA)。DNA DNA重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗传的变异为传的变异为传的变异为传的变异为基础基础基础基础,首先是首先是首先是首先是突变和重组,突变和重组,突变和重组,突变和重组,由此产生由此产生由此产生由此产生遗传变异,遗传变异,遗传变异,遗传变异,然然然然后才有后才有后才有后才有遗传漂变和自然选择,才有遗传漂变和自然选择,才
9、有遗传漂变和自然选择,才有遗传漂变和自然选择,才有生物进化生物进化生物进化生物进化。n重组的意义重组的意义重组的意义重组的意义:uu 能迅速能迅速能迅速能迅速增加群体遗传多样性增加群体遗传多样性增加群体遗传多样性增加群体遗传多样性,使有利与不利突变分开,通,使有利与不利突变分开,通,使有利与不利突变分开,通,使有利与不利突变分开,通过优化组合过优化组合过优化组合过优化组合积累有用的遗传信息积累有用的遗传信息积累有用的遗传信息积累有用的遗传信息。uu 重组参与许多重要生物学过程,重组参与许多重要生物学过程,重组参与许多重要生物学过程,重组参与许多重要生物学过程,为为为为DNADNA损伤或复制障碍
10、提损伤或复制障碍提损伤或复制障碍提损伤或复制障碍提供修复机制供修复机制供修复机制供修复机制。uu 某些生物的基因表达受到某些生物的基因表达受到某些生物的基因表达受到某些生物的基因表达受到重组调节重组调节重组调节重组调节。8同源重组同源重组及其分子模型及其分子模型 概念概念概念概念:由两条同源区由两条同源区由两条同源区由两条同源区DNADNA分子通过分子通过分子通过分子通过配对配对配对配对、链断裂链断裂链断裂链断裂和和和和再连接再连接再连接再连接,产生片段间交换的过程。产生片段间交换的过程。产生片段间交换的过程。产生片段间交换的过程。Holliday Holliday 模型模型模型模型(能能能能
11、解释同源重组现象解释同源重组现象解释同源重组现象解释同源重组现象)四个关键步骤:四个关键步骤:四个关键步骤:四个关键步骤:两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体DNADNA相互靠近并排列整齐;相互靠近并排列整齐;相互靠近并排列整齐;相互靠近并排列整齐;在同一部位在同一部位在同一部位在同一部位两条单链断裂,两条单链断裂,两条单链断裂,两条单链断裂,引发重组;引发重组;引发重组;引发重组;断裂的单链游离端彼此断裂的单链游离端彼此断裂的单链游离端彼此断裂的单链游离端彼此交换,交换,交换,交换,每条链与另一对应链连接,每条链与另一对应链连接,每条链与另一对应链连接,每条链与另一对应链
12、连接,形成形成形成形成HollidayHolliday中间体中间体中间体中间体;分支迁移分支迁移分支迁移分支迁移产生产生产生产生异源双链异源双链异源双链异源双链。两分子间交点沿。两分子间交点沿。两分子间交点沿。两分子间交点沿DNADNA移动,方向移动,方向移动,方向移动,方向任意。任意。任意。任意。9 两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体DNADNA排列整齐;排列整齐;排列整齐;排列整齐;两分子同一部位两分子同一部位两分子同一部位两分子同一部位两个单链断裂,两个单链断裂,两个单链断裂,两个单链断裂,引引引引发重组;发重组;发重组;发重组;断裂后形成单链断裂后形成单链断裂后形
13、成单链断裂后形成单链33游离端,后者侵游离端,后者侵游离端,后者侵游离端,后者侵入到双链入到双链入到双链入到双链DNADNA内,寻找同源区域并内,寻找同源区域并内,寻找同源区域并内,寻找同源区域并配对结合,产生短的链置换区;配对结合,产生短的链置换区;配对结合,产生短的链置换区;配对结合,产生短的链置换区;断裂单链游离端彼此断裂单链游离端彼此断裂单链游离端彼此断裂单链游离端彼此交换,交换,交换,交换,每条链每条链每条链每条链与另一对应链连接,形成与另一对应链连接,形成与另一对应链连接,形成与另一对应链连接,形成HollidayHolliday中间体中间体中间体中间体10通通通通 过过过过 Ru
14、vARuvA和和和和 RuvBRuvB引引引引发发发发分分分分支支支支迁迁迁迁移移移移,产产产产生生生生异源双链异源双链异源双链异源双链DNADNA;通通通通过过过过RuvCRuvC形形形形成成成成拆拆拆拆分分分分口口口口,将将将将四四四四链链链链DNADNA复复复复合合合合体体体体按按按按不不不不同同同同方方方方向向向向拆拆拆拆分分分分,形形形形成成成成片片片片段段段段重重重重组组组组体体体体和和和和拼拼拼拼接重组体接重组体接重组体接重组体。12Holliday中间体通过中间体通过分支移动分支移动产生异源双链产生异源双链DNA。异构化后异构化后通过不同切割方式产生不同重通过不同切割方式产生不
15、同重组分子:组分子:如果切开的链如果切开的链并非原来断裂的并非原来断裂的链链,重组体异源双链区的两侧,重组体异源双链区的两侧来自来自不同亲本不同亲本DNA,称,称拼接重拼接重组体(左)组体(左),但如切开的链与但如切开的链与原来断裂的是原来断裂的是同一条链同一条链,重组,重组体含一段体含一段异源双链区异源双链区,其两侧,其两侧来自来自同一亲本同一亲本DNA,称片段重称片段重组体(右)组体(右)1314同源重组的过程同源重组的过程很精确很精确,一个核苷酸的差,一个核苷酸的差错都会造成基因失活。错都会造成基因失活。同源重组的同源重组的分子基础是分子基础是DNA链间配对链间配对,通通过碱基配对才能找
16、到正确的位置进行链交过碱基配对才能找到正确的位置进行链交换。换。实验表明,两个实验表明,两个DNA分子必需具有分子必需具有75 bp以以上的同源区才能发生同源重组上的同源区才能发生同源重组,小于此数,小于此数值时将显著降低重组率。值时将显著降低重组率。同源重组的同源重组的酶学分子基础酶学分子基础:RecBCD途径:途径:起始于对重组起始于对重组DNA分子中分子中的一条双链的一条双链DNA进行双链切断。进行双链切断。RecBCD蛋白蛋白(RecB、RecC和和RecD基因的基因的产物产物)结合到结合到DNA双链断裂位点,并利用双链断裂位点,并利用RecBCD蛋白本身具有的蛋白本身具有的DNA解旋
17、酶活性解旋酶活性,向具有向具有5-GCTGGTGG-3序列的序列的Chi位点位点进进行行DNA解旋。解旋。1516 (1)Chi位点和位点和RecBCD核酸酶核酸酶原核生物有许多引发重组的方式原核生物有许多引发重组的方式Chi位点能激发重组位点能激发重组:存在于大肠杆菌的存在于大肠杆菌的Chi位点位点,含非对称含非对称8 bp序列序列(5-GCTGGTGG-3)每每510 kb出现一次出现一次.当:当:1)DNA以以游离单链游离单链3端端形式存在时形式存在时 【辐射损伤、基因组经滚环复制产生辐射损伤、基因组经滚环复制产生辐射损伤、基因组经滚环复制产生辐射损伤、基因组经滚环复制产生】2)噬菌体的
18、一些噬菌体的一些突变体,突变体,3)单一碱基对的改变单一碱基对的改变 都能产生都能产生激发重组激发重组的的Chi位点位点。17Chi位点是位点是基因基因rec BCD编码的编码的RecBCD酶酶 作用靶位作用靶位.RecBCD是多功能酶是多功能酶,有三种活性:有三种活性:依赖依赖ATP核酸外切酶活性核酸外切酶活性;可被可被ATP增强的增强的核酸内切酶活性核酸内切酶活性;ATP依赖的依赖的解螺旋酶活性解螺旋酶活性。18当当当当DNADNA分子断裂,分子断裂,分子断裂,分子断裂,RecBCDRecBCD即即即即结合在游离端结合在游离端结合在游离端结合在游离端,使双链解旋并降解使双链解旋并降解使双链
19、解旋并降解使双链解旋并降解;酶移动到酶移动到酶移动到酶移动到ChiChi位点位点位点位点33侧侧侧侧4646个个个个nt nt,将链切开,产生,将链切开,产生,将链切开,产生,将链切开,产生33游离单链端。游离单链端。游离单链端。游离单链端。33游离单链端引发异源双游离单链端引发异源双游离单链端引发异源双游离单链端引发异源双链形成。链形成。链形成。链形成。RecARecA在在在在33端与同源双螺旋端与同源双螺旋端与同源双螺旋端与同源双螺旋序列反应产生交联分子。序列反应产生交联分子。序列反应产生交联分子。序列反应产生交联分子。在在E.coli基因组中平均每基因组中平均每5000bp就有一个就有一
20、个Chi位点位点。RecBCD蛋白还具有蛋白还具有外切双链和单链的活性外切双链和单链的活性,也具有单链内切核酸酶活性。也具有单链内切核酸酶活性。使使RecBCD蛋白蛋白可可产生产生3单链末端单链末端,该末端能,该末端能被被RecA蛋白和蛋白和SSB包裹包裹。RecBCD蛋白也协蛋白也协助助RecA装载到装载到3-DNA末端。末端。RecA蛋白使单蛋白使单链末端侵入到其它双链链末端侵入到其它双链DNA内,寻找能配对内,寻找能配对的同源区域,进而配对结合的同源区域,进而配对结合,当配对区间延,当配对区间延伸扩展,产生链置换区伸扩展,产生链置换区-(分支迁移分支迁移分支迁移分支迁移)。19分支迁移分
21、支迁移实际上是实际上是在在RuvC作用下作用下,两条,两条DNA分子之间交叉的同源单链互相置换的结分子之间交叉的同源单链互相置换的结果,迁移方向可朝向果,迁移方向可朝向DNA分子的任意一端。分子的任意一端。因此,因此,在重组区段在重组区段每条双链中均有一段每条双链中均有一段DNA单链来自另一个双链中的相对链,这一部分单链来自另一个双链中的相对链,这一部分称为称为异源双链(异源双链(hetero duplex)。20RecBCD蛋白蛋白能产生能产生3末端并发动该末端末端并发动该末端侵入双链侵入双链DNA的过程的过程依赖于依赖于ATP和和Mg2+两种两种物质的相对浓度物质的相对浓度。机制如下:机制
22、如下:RecBCD蛋白蛋白首先首先 结合在双链结合在双链DNA上上 并并使之解链使之解链;21当当当当ATPATP浓度大于浓度大于浓度大于浓度大于MgMg2+2+浓度浓度浓度浓度时,时,时,时,大部分大部分大部分大部分MgMg2+2+被被被被ATPATP螯合。螯合。螯合。螯合。RecBCDRecBCD蛋白的解旋酶活性蛋白的解旋酶活性蛋白的解旋酶活性蛋白的解旋酶活性向着向着向着向着ChiChi位点方向打开位点方向打开位点方向打开位点方向打开DNADNA双链,形成有双链,形成有双链,形成有双链,形成有33末端的凸形末端的凸形末端的凸形末端的凸形DNADNA结构。当结构。当结构。当结构。当RecBC
23、DRecBCD到达到达到达到达ChiChi位点,就位点,就位点,就位点,就切割切割切割切割ChiChi位点下位点下位点下位点下游的核苷酸游的核苷酸游的核苷酸游的核苷酸,且由,且由,且由,且由RecARecA蛋白蛋白蛋白蛋白包裹环凸的包裹环凸的包裹环凸的包裹环凸的DNADNA,RecBCDRecBCD继续解开继续解开继续解开继续解开DNADNA螺旋,形成螺旋,形成螺旋,形成螺旋,形成33端覆盖着端覆盖着端覆盖着端覆盖着RecARecA蛋白的单链蛋白的单链蛋白的单链蛋白的单链33末端末端末端末端;22 当当当当MgMg2+2+浓度大于浓度大于浓度大于浓度大于ATPATP浓度浓度浓度浓度时时时时,大
24、量,大量,大量,大量MgMg2+2+未被螯合,未被螯合,未被螯合,未被螯合,RecBCDRecBCD蛋白解旋酶活性同样蛋白解旋酶活性同样蛋白解旋酶活性同样蛋白解旋酶活性同样向着向着向着向着ChiChi方向打开方向打开方向打开方向打开DNADNA双链,双链,双链,双链,形成有形成有形成有形成有33末端的凸形结构,在末端的凸形结构,在末端的凸形结构,在末端的凸形结构,在环后降解环后降解环后降解环后降解DNADNA,当当当当RecBCDRecBCD蛋蛋蛋蛋白到达白到达白到达白到达ChiChi位点时,位点时,位点时,位点时,RecARecA蛋白蛋白蛋白蛋白结合到环突结合到环突结合到环突结合到环突DNA
25、DNA上上上上,RecBCDRecBCD停止降解停止降解停止降解停止降解33末端。开始切割末端。开始切割末端。开始切割末端。开始切割55末端的链,并末端的链,并末端的链,并末端的链,并激活激活激活激活5533外切核酸活性外切核酸活性外切核酸活性外切核酸活性,降解,降解,降解,降解55端的链端的链端的链端的链,最终留下一个覆盖着,最终留下一个覆盖着,最终留下一个覆盖着,最终留下一个覆盖着RecARecA的单链的单链的单链的单链DNADNA。23Chi位点位点 在在在在细菌中细菌中细菌中细菌中通常不存在大量双螺旋通常不存在大量双螺旋通常不存在大量双螺旋通常不存在大量双螺旋DNADNA的交换,而是的
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