流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规范.doc
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1、流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规范流感病毒的血凝素(HA)能够引起多种禽类和哺乳动物的红细胞发生凝集,因此而得名。用于检测流感病毒滴度的红细胞凝集试验也是根据病毒的这一特性而建立的。当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后,则可以抑制红细胞凝集的出现,即为红细胞凝集抑制试验(HI)的理论根据。微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型的方法。该方法简单、易行、结果可信。用于HI的标准参照血清必须及时更新,要包括当年的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。(一)生物安全要求生物安全要求及个人防护要求与流
2、感病毒的分离相同,并应遵守相应的生物安全规定。(二)实验所用试剂1. 抗原:季节性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液2. 抗血清:经RDE或者过碘酸钾处理后的季节性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。(三)其他试剂/材料/仪器(试剂盒中不包含)1. 红细胞悬液2. PBS缓冲液,PH7.43. 水浴箱(37,56)4. 台式离心机5. 多道可调加样器6. 离心管7. 96孔微量血凝板(使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板,使用鸡/火鸡红细胞进行实验
3、最好用“V”底板,“U”底板也可使用)、可调多通道加样器、单道加样器等。8. 200ul、1000ulTIP头、水槽流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞鸡火鸡豚鼠人“O”型血终浓度0.50.50.750.75孔底部形状V型V型U型U型孵育时间30min30min45min60min红细胞沉积形状细胞沉积成点状,倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成点状,倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状(四)流感病毒鉴定步骤1. 红细胞配置如用火鸡、鸡的红细胞,工作液浓度为1%,如用人“O”型、豚鼠红细胞,工作浓度为1.5%。下面介绍WHO流感参比与合作中心提供的红细胞标定的方法:(1) S
4、液中的红细胞,1200r/min离心5min,弃上清。(2) 加入等量的PBS液体洗涤,充分混匀,1200r/min离心5min,弃上清。(3) PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后,1200r/min离心10min。(4) 将红细胞稀释至合适的浓度。注:A.S液全称为Alsever氏液。配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL,微热溶解,将pH值调到6.1,8磅20min高压灭菌,4贮存备用。2. 流感毒株HA滴度的测定(1) 在微量血凝板的第212列加入50ul PBS(PH7.4)。(2) 在第一列(A1G1)中加入100u
5、l病毒悬液。(3) H1加入100ul PBS,作为红细胞阴性对照。(4) 从第一列各孔吸50ul病毒液,由第1列至第12列做2倍系列稀释,最后一列每孔弃去50ul。(5) 在每孔中加入50ul红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。(6) 室温孵育,孵育时间见表:流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较。3. HA试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“+”记录;只有部分红细胞凝集记录为“+/-”;无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点,其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。HA滴度判定举例病毒稀释度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:256
6、1:5121:10241:2048123456789101112A+-2B+-8C+-16D+-32E+-64F+-128G+2048H-14. 制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原(1) 一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。(2) 制备4个单位血凝抗原时,首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每种血清做8孔稀释,每孔用抗原25ul,则测定一份血清需0.2mL抗原。根据标准血清的份数(本试剂盒包含5种标准血清)计算出实验所需病毒抗原总量。(3) 其次,计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8,得到的商
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