植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测学习教案.pptx
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1、会计学1植物植物(zhw)总总DNA提取及琼脂糖凝胶电提取及琼脂糖凝胶电泳检测泳检测第一页,共26页。n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(h sun)(DNA)(h sun)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(h sun)(RNA)(h sun)(RNA)n与蛋白质结合在一起以核蛋白(与蛋白质结合在一起以核蛋白(DNPDNP)的形式存在。在制)的形式存在。在制备核酸备核酸(h sun)(h sun)时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。释放出来。n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存在于细胞前者存在于细胞
2、核内,后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器核内,后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内,例如线粒体内,例如线粒体DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和叶绿体和叶绿体DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景背景(bijng)知识知识核酸核酸(h sun)的存的存在形式在形式第1页/共26页第二页,共26页。nDNADNA为白色类似石棉样的纤维状物,为白色类似石棉样的纤维状物,RNARNA的纯品呈白的纯品呈白色粉末或结晶。色粉末或结晶。nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的
3、钠盐比游离不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离(yul)(yul)酸易溶于水。酸易溶于水。n在酸性溶液中,核酸易水解,中性或弱碱性溶液中在酸性溶液中,核酸易水解,中性或弱碱性溶液中较稳定。较稳定。核酸核酸(h sun)(h sun)的理化的理化性质性质第2页/共26页第三页,共26页。细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀沉淀(chndin)(chndin)核酸核酸基本基本(jbn)过过程程第3页/共26页第四页,共26页。机械机械(jxi)(jxi)方法:方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;超声波处理法、研磨法、匀浆法;化学试剂法:用化学试剂法:用SDSSDS处理细胞;处理
4、细胞;酶解法:酶解法:加入溶菌酶,破坏细胞壁。加入溶菌酶,破坏细胞壁。细胞细胞(xbo)(xbo)破碎破碎 第4页/共26页第五页,共26页。uSDSSDS法法 SDSSDS是是有有效效的的阴阴离离子子去去垢垢剂剂,细细胞胞中中DNADNA与与蛋蛋白白质质之之间间常常借借静静电电引引力力或或配配位位键键结结合合,SDSSDS能能够够破破坏坏这这种价键。种价键。uCTABCTAB法法 CTABCTAB是是一一种种阳阳离离子子去去垢垢剂剂,它它可可以以溶溶解解(rngji)(rngji)膜膜与与脂脂膜膜,使使细细胞胞中中的的DNA-DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物释放出来,并使蛋白质变性,使释放出
5、来,并使蛋白质变性,使DNADNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。DNADNA提取提取(tq)(tq)第5页/共26页第六页,共26页。u蛋白质蛋白质 常用苯酚:氯仿:异戊醇(常用苯酚:氯仿:异戊醇(2525:2424:1 1)或)或氯仿:异戊醇(氯仿:异戊醇(2424:1 1)抽提。)抽提。uRNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ,或是,或是(hu sh)(hu sh)用用LiClLiCl来消来消除大分子的除大分子的RNARNA。u酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇,选取幼嫩的材提取液中加少量巯基乙醇,选取幼嫩的材料。料。u多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPV
6、P。DNADNA纯化纯化(chn hu)(chn hu)(去杂质)(去杂质)第6页/共26页第七页,共26页。实验材料实验材料 新鲜蔬菜叶片新鲜蔬菜叶片(ypin)(ypin)(去叶脉去叶脉)试剂试剂 2CTAB 2CTAB抽提液抽提液 TE TE 缓冲液缓冲液(pH=8.0)(pH=8.0)氯仿:异戊醇氯仿:异戊醇(24:1)(24:1)材料材料(cilio)与试剂与试剂第7页/共26页第八页,共26页。离心机离心机 水浴锅水浴锅研钵研钵(yn b)(yn b)微量移液器微量移液器仪器仪器(yq)用具用具第8页/共26页第九页,共26页。移液器量程移液器量程(lingchng)的选择的选择第
7、9页/共26页第十页,共26页。1取取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中,加清洗凉干的新鲜叶片于研钵中,加 1/3 药匙石英砂药匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液,迅速研磨提取液,迅速研磨(ynm)。2将将 1mL 研磨研磨(ynm)液转入液转入 1.5mL 离心管中,置于离心管中,置于65水浴中保温水浴中保温 20min,其间颠倒混匀,其间颠倒混匀23次。破碎细胞次。破碎细胞3.12000r/min 离心离心 5min,取上清液,取上清液700L转到另一离心转到另一离心管中。加入等体积氯仿:异戊醇(管中。加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混合液,充分)混合液,充分颠倒混匀。
8、颠倒混匀。12000r/min,离心,离心 5min。抽提去蛋白。抽提去蛋白4将上清液移入新的将上清液移入新的1.5mL离心管内,加离心管内,加 600L异丙醇。颠异丙醇。颠倒混匀,可见倒混匀,可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸絮状沉淀。沉淀核酸512000r/min,离心,离心 1min,倒掉上清液,将离心管倒置干,倒掉上清液,将离心管倒置干燥。燥。将沉淀回溶于将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。缓冲液待测。操作步骤操作步骤第10页/共26页第十一页,共26页。1)选取新鲜材料,研磨迅速彻底,研磨好的材料应与选取新鲜材料,研磨迅速彻底,研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混抽提液充分混匀;
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