第五章--血清学反应--免疫学课件.ppt
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1、 第五章第五章 免疫血清学技术免疫血清学技术 第一节第一节、血清学反应的概述血清学反应的概述(一)概念(一)概念 又称抗原抗体反应,抗原与相应抗体在体内外均能发生特异又称抗原抗体反应,抗原与相应抗体在体内外均能发生特异性结合的反应。由于抗体主要存在于血清中,故称为血清学反性结合的反应。由于抗体主要存在于血清中,故称为血清学反应。应。在体内在体内抗原抗体结合可作为体液免疫应答的效应机制。抗原抗体结合可作为体液免疫应答的效应机制。在体外在体外抗原抗体结合能发生可见的免疫反应。抗原抗体结合能发生可见的免疫反应。体外抗原抗体反应中的抗体主要来源于血清,体外抗原抗体反应中的抗体主要来源于血清,其检测多以
2、血清为实验材料其检测多以血清为实验材料.(二)(二)类型 1 1、凝集反应、凝集反应 、沉淀反应、沉淀反应 3 3、标记抗体技术、标记抗体技术 4 4、补体结合反应、补体结合反应 5 5、中和反应、中和反应(二)、经典血清学反应的类型(二)、经典血清学反应的类型类型 抗原 抗体 辅助物凝集反应 颗粒性 凝集素 沉淀反应 可溶性 沉淀素 补体结合反应 红细胞 溶血素 补体 G-细菌 溶菌素 补体中和反应 外毒素 抗毒素 靶细胞 病毒 中和抗体 靶细胞(三)(三)经典经典血清学反应(凝集和沉血清学反应(凝集和沉淀)的影响因素淀)的影响因素1、电解质:常应用0.85%的氯化钠作为稀释液,禽类血清需8
3、-10%的氯化钠.2、温度:一般反应在37进行 3、pH:pH 6-8 第二节第二节 凝集反应凝集反应 一、一、凝集反应凝集反应(一)、直接凝集反应(二)、间接凝集反应 (1)(1)方法:方法:将含有已知抗体的诊断血清将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释适当稀释)与待检与待检菌悬液各一滴在玻片上混匀,数分钟后,如出现颗粒状或絮状菌悬液各一滴在玻片上混匀,数分钟后,如出现颗粒状或絮状凝集,即为阳性反应。此法简便快速。凝集,即为阳性反应。此法简便快速。(2)结果:结果:阳性阳性-类似粉笔沫样凝集物漂浮澄清液滴中;类似粉笔沫样凝集物漂浮澄清液滴中;阴性阴性-无凝集物,液滴浑浊。无凝集物,液滴浑浊。1
4、)1)、玻片法玻片法(3)用途意义:用途意义:用已知抗体诊断抗原(病原)用已知抗体诊断抗原(病原)也可用已知的诊断抗原悬液,检测待检血清中是否存也可用已知的诊断抗原悬液,检测待检血清中是否存在相应抗体,进行流行病学调查。在相应抗体,进行流行病学调查。常用于布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。常用于布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。(3)用途意义:是一种定性与定量相结是一种定性与定量相结合的方法。用已知抗原检测待测血清中是合的方法。用已知抗原检测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量。否存在相应抗体和测定该抗体的含量。正向间接凝集反应正向间接凝集反应可溶性抗原载体
5、颗粒反向间接凝集反应反向间接凝集反应抗体可溶性抗原载体颗粒(2 2)间接血凝试验间接血凝试验(IHAT)原理示意图原理示意图(3)、协同凝集试验 与间接凝集试验的原理相似,只是所用载体而是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌的菌体细胞壁中含有A蛋白(SPA),SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时,就成为抗体致敏的颗粒载体;如与相应抗原接触,即出现反向间接凝集试验。适用于细菌和病毒等的直接检测。三、免疫标记技术三、免疫标记技术 (一)原理(一)原理:抗原与抗体能特异性结合,但抗体、抗原分子:抗原与抗体能特异性结合,但抗体、抗原分子小,在含量低时形成的抗原抗体复合物
6、是不可见的。将荧光素、酶分子、小,在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。将荧光素、酶分子、胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上,可以通过检测标记分子来胶体金、放射性同位素等标记在抗体分子上,可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在,此种根据抗原抗体结合的特异性和标记分显示抗原抗体复合物的存在,此种根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术,称为标记抗体技术。子的敏感性建立的技术,称为标记抗体技术。标记免疫技术一般分为两类:标记免疫技术一般分为两类:(1 1)免疫组化技术)免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)(immunohistoche
7、micaltechnique):用于组织切片或其他标本中用于组织切片或其他标本中AgAg或或AbAb的定位。的定位。(2 2)免疫测定)免疫测定(immunoassay)(immunoassay):用于液体标本中:用于液体标本中AgAg或或AbAb的测定的测定。第二节第二节 沉淀反应沉淀反应 (一)原理:(一)原理:可溶性抗原可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液,病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等素、菌体裂解液,病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应抗体结合,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的白与相应抗体结合,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的白色沉淀,称
8、为沉淀试验。参与沉淀试验的抗原称沉淀原,抗色沉淀,称为沉淀试验。参与沉淀试验的抗原称沉淀原,抗体称为沉淀素。体称为沉淀素。可溶性抗原可溶性抗原免疫血清免疫血清(抗体)(抗体)比例适合比例适合0.85%或或8%NaCl溶液溶液出现沉淀现象出现沉淀现象沉淀原沉淀原沉淀素沉淀素比例不适合比例不适合无沉淀现象无沉淀现象+一、沉淀反应概述一、沉淀反应概述一、琼脂扩散试验 用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶,其内部为多孔网状。而且孔径很大,可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上,所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖
9、凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点,因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。1、单向扩散试验、单向扩散试验倾注平板打孔加样倾注平板打孔加样 放置放置373724244848h h观察沉淀环观察沉淀环 2 2、双向单扩散试验(平板法)、双向单扩散试验(平板法)应用应用1.1.抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测与否以及相对含量的估计与否以及相对含量的估计 双向扩散试验双向扩散试验应用应用2.2.抗原性质的分析抗原性质的分析 双向扩散试验双向扩散试验 二、免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳:抗原分析对流免疫电泳:快速、半定量测定火箭电泳:快速、定量测定优点:优点:
10、1.1.加快反应的速度。加快反应的速度。2.2.提高了灵敏度。提高了灵敏度。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。电泳分析电泳分析沉淀反应沉淀反应抗原抗体反应抗原抗体反应的高度特异性的高度特异性电泳技术的高电泳技术的高分辨率、快速、分辨率、快速、微量微量免疫电泳技术免疫电泳技术原理:双向扩散原理:双向扩散+电泳电泳比双向扩散试验灵比双向扩散试验灵敏度提高敏度提高8 8 1616倍倍技术要点:制备技术要点:制备1.2%1.2%巴比妥巴比妥琼脂凝胶板,在其上成对打琼脂凝胶板,在其上成对打孔,孔径孔,孔径3 3mmmm,孔距孔距6 6 mmmm,于阴极侧孔内加待测血清,于阴极侧孔内加待测血清,阳性侧孔
11、加抗血清,电泳条阳性侧孔加抗血清,电泳条件件3 34mA/cm4mA/cm,30min30min1 1h h。(一)、对流免疫电泳(一)、对流免疫电泳通电通电蛋白质抗原常蛋白质抗原常带较强的负电带较强的负电荷,在电场中荷,在电场中向正极移动向正极移动抗体球蛋白抗体球蛋白带负电荷较少,带负电荷较少,籍电渗作用向籍电渗作用向负极泳动负极泳动 对流免疫电泳对流免疫电泳结果分析:结果分析:无沉淀线出现则表明无沉淀线出现则表明无相应的抗原。无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体沉淀线位于抗原抗体孔中间,说明两者比孔中间,说明两者比例较适合。例较适合。沉淀线偏向抗原孔一沉淀线偏向抗原孔一方,表示抗体浓度方,表示
12、抗体浓度抗原,反之,则是抗抗原,反之,则是抗体浓度抗原浓度。体浓度抗原浓度。对流免疫电泳对流免疫电泳电泳时凝胶中抗体不移动,样品孔中的电泳时凝胶中抗体不移动,样品孔中的抗原向正极泳动,随着抗原量的逐渐减抗原向正极泳动,随着抗原量的逐渐减少,抗原泳动的基底区越来越窄,抗原少,抗原泳动的基底区越来越窄,抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄,抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄,形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰,抗体浓度固定时,峰的高度与抗淀峰,抗体浓度固定时,峰的高度与抗原量呈正相关。原量呈正相关。原理原理免疫扩散电泳免疫扩散电泳,定量检测技术定量检测技术(
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